粟酒裂殖酵母必需基因省略抑制子的系统筛选和机制研究

摘要

本文主要从以下几个方面进行论述：
　　第一部分 通过筛选过表达省略抑制子研究粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe必需基因缺失的可弥补性
　　在单细胞物种中，必需基因可被简单定义为在正常培养条件下对细胞生长所必需的基因。因此必需基因常控制细胞内核心的生物学过程，也在不同物种间具有很高的保守性[1]。功能基因组学的研究表明，有些基因在不同的物种间显示出不同的必需性[2]，这表明基因的必需性受遗传环境影响。遗传学实验还曾发现某些必需基因缺失造成的致死表型可以被单个突变所挽救，这种突变被称为省略抑制子。为系统研究省略抑制现象，我们在粟酒裂殖酵母S.pombe中对其Ⅱ号染色体左臂的165个必需基因开展了省略抑制子筛选。
　　在本课题中，我们通过覆盖几乎整个基因组的过表达质粒文库观察单个基因的过表达对必需基因缺失的弥补性影响。我们首先在S.pombe中建立了一套可靠的筛选过表达省略抑制子(overexpression-mediated bypass-of-essent ial-gene(O-BOE) suppressors）的方法，并成功对128个必需基因进行了O-BOE的筛选以及鉴定。
　　通过我们的实验结果，我们发现在S.pombe的基因组中，约12.5％的必需基因缺失的致死表型能被单个过表达质粒所挽救（省略抑制）。而大部分必需基因都筛选不到过表达省略抑制子，这表明细胞内的必需基因不是同等重要的。通过分析我们发现有O-BOE抑制子的必需基因与没有O-BOE抑制子的必需基因相比，基因的进化速率更快，在不同物种间的保守性更低。同时，在蛋白质相互作用的网络中，这些基因也不倾向成为网络中的中心，和形成聚集的模块。这表明这些可被省略抑制的必需基因，在特征上更接近非必需基因。
　　通过分析过表达省略抑制相互作用的模式，我们发现编码同一个蛋白复合体中不同蛋白的必需基因，或者在相同生物学通路中起作用的必需基因的过表达省略抑制子之间会出现交集，这表明系统性的省略抑制子研究有可能帮助我们找到必需基因相互作用的模块。而我们进一步的分析表明，过表达省略抑制遗传相互作用有助于揭示基因的必需生物学功能，如res1可被Cdc18过表达省略抑制，这表明res1的必需功能可能是在细胞周期的G1/S转变过程中激活Cdc18的转录;同时我们发现多个磷脂酶的过表达可以省略抑制ERMES(ER-mitochondria encounter site)复合体中的基因，这意味着ERMES复合体的必需功能与脂质的调控有关;同时过表达省略抑制相互作用可将不同的生物学过程之间建立联系，比如线粒体核糖体亚基mrp21与mrps28的缺失可被参与小分子RNA代谢过程的Dcr1省略抑制提示线粒体功能与小分子RNA之间可能存在联系。这些例子表明过表达省略抑制相互作用不仅可以揭示细胞内不同生物学过程之间的关系、发现细胞内的必需功能模块，同时也为我们研究必需基因在细胞内的功能提供有价值的线索。
　　第二部分 探索SUMO靶向泛素连接酶Slx8-Rfp1/Rfp2在粟酒裂殖酵母中的必需功能
　　SUMO靶向泛素连接酶(STUbL)是一类从单细胞酵母至人中结构与功能都非常保守的蛋白。这类酶的存在表明细胞内被SUMO修饰的蛋白可能会被蛋白酶体降解。在酵母S.cerevisiae以及人细胞中，STUbL调节的一些底物已经被发现，但细胞内SUMO与泛素(ubiquitin)之间的这种交互对话的生物学意义以及STUbL家族主要在细胞内调控的生物学过程仍旧不清楚。
　　在粟酒裂殖酵母S.pombe中，STUbL的功能由复合体Slx8-Rfp1/Rfp2实现，且STUbL的功能对于S.pombe细胞的生长是必需的。必需基因通常调节细胞内非常基础核心的生物学过程，因此研究Slx8的必需功能不仅可帮助我们认识STUbL在S.pombe中的作用机理，也可能帮助我们理解整个STUbL家族蛋白主要调控的生物学过程。
　　我们通过piggyBac(PB)转座子以及酵母的过表达文库对必需基因的省略抑制子筛选发现Slx8的缺失造成的致死表型可被多个基因的功能缺失或过表达挽救。我们着重通过转座子介导的省略抑制子(T-BOE)对Slx8的必需功能进行了机理的研究。我们发现Slx8的必需功能与细胞内被SUMO修饰的蛋白有关，突变参与SUMO修饰过程的基因(pli1⊿、fub2_C_ins)可显著降低细胞内整体水平的SUMO修饰而省略抑制Slx8的必需功能。Slx8的必需功能与核孔复合体以及Ulp1之间也存在着密切相关性:核孔蛋白Nup132的缺失、Nup189 C端氨基酸的缺失，以及去SUMO修饰蛋白酶Ulp2的缺失均可省略抑制Slx8的必需功能，同时这些突变也影响去SUMO修饰蛋白酶Ulp1在核膜上的定位。我们的实验进一步表明，这些突变可能通过影响Ulp1蛋白在核膜上的定位而省略抑制Slx8的必需功能。
　　T-BOE实验还发现一个功能不明确的蛋白Rrp2的缺失也可省略抑制Slx8的必需功能。我们通过进一步分析发现该蛋白的SUMO结合序列SIM对于其在slx8突变体中发挥生长抑制作用（毒性）有非常重要的作用，这表明Rrp2蛋白可能与被SUMO修饰的底物直接结合而产生毒性。不仅如此，我们也发现Rrp2可能具有通过其N端区域自我相互作用形成多聚体的能力。通过ChIP-seq实验我们还发现Rrp2特异结合于基因组的非编码区域，这一发现表明Slx8的必需功能可能与Rrp2对非编码区域的DNA调节有关。因此我们对Slx8的研究提示，Slx8的必需功能可能是调节细胞核内染色体上的Rrp2与核孔复合体定位的Ulp1之间的某种生物学联系。

目录

第一部分 通过筛选过表达省略抑制子研究粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe必需基因缺失的可弥补性

摘要

第一章 引言

1．1 必需基因的定义及其特性

1．2 粟酒裂殖酵母S．pombe及其必需基因的介绍

1．3 遗传相互作用以及省略抑制子的定义

1．4 系统性遗传相互作用的研究及其意义

1．5 对生物网络结构的理解以及非必需基因与必需基因在生物网络中的特征

1．6 基因过表达会产生什么生物学效果?过表达表型出现的几种可能机理

1．7 过表达介导的遗传相互作用研究情况

1．8 本研究目的与意义

第二章 实验仪器与试剂

2．1 实验仪器

2．2 实验试剂

2．3 本实验所使用的菌株

第三章 实验方法

3．1 构建过表达省略抑制筛选的query菌株(O-BOE query strains)

3．2 提取过表达质粒文库

3．3 构建过表达酵母文库

3．4 筛选过表达省略抑制子

3．5 制备O-BOE高通量测序样品

3．6 分析高通量测序实验结果

3．7 通过实验验证筛选得到的过表达省略抑制子

3．8 半定量分析比较必需基因省略抑制子之间的生长强弱

3．9 验证过表达省略抑制子是否依赖于其C端的YFH标签

3．10 RNA提取与测序

3．11 数据处理

第四章 实验结果

4．1 过表达酵母文库可有效包含S．pombe ORFeome过表达质粒文库的信息

4．2 O-BOE筛选系统可有效富集过表达抑制子

4．3 S．pombe中约1 2．5％的必需基因可通过过表达Yoshida质粒省略抑制

4．4 S．pombe必需基因的过表达省略抑制遗传关系富集与必需基因参与相同生物学过程的基因

4．5 可被过表达质粒省略抑制的必需基因相较于不能省略抑制的必需基因拥有更低的蛋白表达量

4．6 可被过表达质粒省略抑制的必需基因相较于没有OP-BOE的必需基因保守性更低、进化速率更快

4．7 过表达质粒省略抑制子的特征

4．8 过表达省略抑制子可帮助揭示基因的必需功能

第五章 小结与讨论

5．1 过表达质粒文库与过表达省略抑制子

5．2 过表达省略抑制筛选系统的鲁棒性

5．3 过表达省略抑制关系

5．4 paralogous基因对必需基因的省略抑制

5．5 可被省略抑制的必需基因与不可被省略抑制的必需基因

第二部分 探索SUMO靶向泛素连接酶Slx8-Rfp1／Rfp2在粟酒裂殖酵母中的必需功能

摘要

第一章 引言

1．1 SUMO修饰系统

1．2 Slx8的发现及其生化活性

1．3 细胞内STUbL底物的研究进展

1．4 核孔复合体与SUMO修饰系统的关系

1．5 在粟酒裂殖酵母S．pombe中Slx8的研究进展及本研究的研究目的和意义

第二章 实验试剂与仪器

2．1 实验试剂

第三章 实验方法

3．1 酵母转化

3．2 四分子分析

3．3 用碱裂解和三氯乙酸提取蛋白

3．4 在大肠杆菌中重组表达并提取Pmt3GG(成熟的Pmt3形式)蛋白

3．5 蛋白质的亲和纯化及质谱分析

3．6 蛋白质印迹杂交

3．7 亲和纯化细胞中被SUMO修饰的蛋白及其质谱鉴定

第四章 实验结果

4．1 遗传筛选发现在S．pombe中Slx8的必需功能可被多个基因突变体省略抑制

4．2 slx8的省略抑制子分属于几种不同的信号通路

4．3 Nup107核孔复合体可能通过调节去SUMO修饰蛋白酶Ulp1的定位参与Slx8必需功能的省略抑制

4．4 内源表达的Ulp1在Slx8缺失时可导致细胞死亡

4．5 Rrp2的多个功能区域参与slx8Δ的致死过程

4．6 Slx8省略抑制子可影响Rrp2在细胞核内成点的能力

4．7 Rrp2蛋白N端不同形式突变体的过表达可回补slx8缺失引起的死亡表型

第五章 小结与讨论

5．1 Ulp1的省略抑制功能以及其与核孔复合体运输的关系

5．2 Rrp2的省略抑制功能及其与Rrp1的关系

5．3 Rrp2与Ulp1在省略抑制slx8必需功能上的关系

5．4 Slx8一Rfp1／Rfp2与Ufd1—Cdc48一Np14复合体之间的关系

5．5 Slx8的过表达省略抑制子及其与染色体结构的关系

参考文献

附录

致谢

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