基于CRISPR/CAS9技术的EML4--ALK融合基因检测参考物质研究

摘要

肺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，也是全球癌症相关致死的主要原因之一。在检出的肺癌患者中，有80％-85％为非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)，且其中大部分病例在确诊时已是中晚期，五年生存率仅为10％-15％。NSCLC的传统治疗包括手术、化疗和放疗等手段，但随着近年来研究者对NSCLC研究的不断深入以及精准医疗的发展，依据患者的遗传信息以制定个体化治疗方案在NSCLC治疗中的作用日益凸显。目前，已有一系列NSCLC靶向治疗相关的基因突变和基因重排分子检测在临床上得以广泛应用。其中人类棘皮动物微管相关蛋白样4(Echinoderm microtubule-associated protein like4，EML4)基因和人类间变性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase，ALK)基因重排形成的融合基因，即EML4-ALK融合基因检测即被证明可用于指导NSCLC患者进行克唑替尼靶向治疗。 目前，EML4-ALK融合基因的常用检测方法有免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)、荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)、实时荧光定量反转录PCR(Real-time quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR)以及新一代高通量测序(Next-generation sequencing，NGS)等多种方法。这些检测方法由于检测原理各异，因此在实际应用过程中不同方法间影响检测结果的因素也各不相同。作为临床实验室，想要得到准确可靠且互通性良好的检测结果，选取合适的参考物质（Reference material，RM）以进行实验室自建方法（Laboratory developed tests，LDTs）的性能确认（Validation）、商品试剂盒的性能验证（Verification）、开展室内质控（Internal quality control，IQC）以及进行室间质评（External quality assessment，EQA）/能力验证（Proficiency testing，PT）是保证检测结果重复性和准确性的关键环节。然而，目前现有的参考物质因难以大批量生产、批间差异大、缺乏典型的组织病理结构且无法适用于所有检测方法等原因，故无法对各检测方法进行全面的性能评估，并且也不能满足实验室检测质量保证（包括IQC及EQA）的需求。因此，为提高各临床实验室EML4-ALK融合基因检测质量，本研究通过采用CRISPR/Cas9技术和异种移植方法，研究制备了一种易于生产、重复性高且可适用于上述所有检测方法的新型EML4-ALK融合基因检测参考物质。 在本研究中，我们以EML4-ALK融合基因阴性的HEK293T细胞作为基础细胞系，通过设计分别靶向EML4基因及ALK基因的sgRNA对HEK293T细胞进行CRISPR/Cas9基因编辑，从而制备含有EML4-ALK融合基因V1、V2及V3a/b型的人工细胞系。这些人工构建的单克隆EML4-ALK融合基因阳性细胞系经DNA水平、RNA水平及蛋白质水平分别验证无误后通过异种移植成瘤以最终制备成为新型的EML4-ALK融合基因检测参考物质。为保证所制备参考物质可适用于所有方法学检测，本研究分别采用了IHC、FISH、RT-qPCR及NGS方法对其进行验证。同时，为保证所制备参考物质的实用性，我们还对其进行了互通性、均一性及稳定性评估。 结果显示，通过对HEK293T细胞进行CRISPR/Cas9基因编辑，本研究共成功构建了三种分别含有EML4-ALK融合基因V1、V2及V3a/b型的人工细胞系，其分别被命名为：1-F8-G9、9-E11-G5及14-F9-E8。这些人工构建的细胞系经DNA水平、RNA水平及蛋白水平验证，均证明含有高丰度的相应的EML4-ALK融合基因变体。通过随后对裸鼠皮下进行异种移植成瘤，经4周生长的异种移植瘤被切割成为约500mm3大小后制备成为石蜡组织块，并最终切割制备成为4μm或10μm厚的福尔马林固定石蜡包埋的(Formalin-fixed，paraffin embedded，FFPE)切片样本，即新型的EML4-ALK融合基因参考物质。经HE染色显示，本研究中所制备的异种移植FFPE参考物质样本组织病理学结构与NSCLC患者的肿瘤组织样本相似，均具有组织坏死、炎症及肿瘤浸润等特点，因此其可良好的模拟天然肿瘤组织结构。而经RNA提取验证，结果显示本研究所制备的新型FFPE参考物质每份可提供至少5μg以上的高质量RNA样本以保证后续检测进行。除此之外，经FISH、IHC、RT-qPCR及NGS检测验证，结果均显示我们所制备的新型FFPE参考物质为EML4-ALK融合基因强阳性，且各方法检测结果与NSCLC患者临床样本结果符合率为100％。同时，经过均一性、稳定性和互通性评估，本研究中制备的新型FFPE参考物质显示出了良好的互通性及均一性，且其可在各种储存条件下稳定保存至少2个月，证实了此新型FFPE参考物质具有良好的实用性。 综上所述，本研究以简单、快速、经济的方式成功制备了一种新型的EML4-ALK融合基因参考物质。与以往的参考物质相比，其具有易于大批量制备、均一性良好、具有类似天然肿瘤的组织病理学结构特征、在处理过程中不易脱片、可长时间稳定保存，并且可避免在不同常规操作中所引发的基质效应等优点。同时由于该参考物质具有相同的基因组背景，因此其可广泛应用于目前所有的EML4-ALK融合基因检测方法（尤其是NGS）的性能确认、试剂盒性能验证以及日常检测质量控制，为各临床实验室进行准确检测提供了保障。不仅如此，本研究中所采用的通过CRISPR/Cas9技术编辑构建具有相同基因组背景但含有不同突变或重排的人工细胞系这一方式也可为未来其他参考物质（如肿瘤组织基因突变检测参考物质、肿瘤游离DNA基因突变检测参考物质等）的研制提供了新的思路与方法。

目录

声明

英文缩略词

摘要

前言

1． 材料和方法

1．1实验材料和试剂配制

1．1．1实验仪器

1．1．2实验耗材

1．1．3实验试剂

1．1．4溶液配制

1．1．5细胞系

1．1．6菌株及载体

1．1．7实验动物

1．2实验方法

1．2．1 HEK293T细胞系及各非小细胞肺癌细胞系的培养

1．2．2 HEK293T细胞系EML4-ALK融合基因状态验证

1．2．3 CRISPR／Cas9技术构建EML4-ALK融合基因阳性细胞系

1．2．4基于CRISPR／Cas9技术构建的EML4-ALK融合基因阳性细胞系验证

1．2．5携带相关EML4-ALK融合基因的异种移植动物模型建立

1．2．6新型EML4-ALK融合基因参考物质制备及验证

1．2．7新型EML4-ALK融合基因参考物质均一性及稳定性探究

2．结果

2．1．2 HEK293T细胞系EML4-ALK融合基因状态验证

2．2 CRISPR／Cas9技术构建层ML4-ALK融合基因阳性细胞系

2．2．2 pX330载体验证

2．2．3 pX330-sgRNA重组质粒载体验证

2．2．4 pX330-sgRNA重组质粒载体筛选

2．2．5混合克隆制备及验证

2．2．6单克隆细胞筛选

2．3 新型EML4-ALK融合基因阳性细胞系验证

2．3．1 DNA水平验证

2．3．2 RNA水平验证

2．3．3蛋白质水平验证

2．4异种移植动物模型建立

2．5 新型EML4-ALK融合基因参考物质制备及验证

2．5．1新型EML4-ALK融合基因参考物质制备

2．5．2新型EML4-ALK融合基因参考物质IHC方法验证

2．5．3新型EML4-ALK融合基因参考物质FISH方法验证

2．5．4新型EML4-ALK融合基因参考物质RT-qPCR方法验证

2．5．5新型EML4-ALK融合基因参考物质NGS方法验证

2．6 新型EML4-ALK融合基因参考物质均一性及稳定性探究

2．6．2新型EML4-ALK融合基因参考物质稳定性验证

3．讨论

参考文献

论文综述

附录

致谢

个人简介