UGT1A1基因多态性检测室间质量评价及基于CRISPR/Cas9系统的EML4-ALK融合基因检测的研究

摘要

伊立替康是广泛用于治疗晚期结直肠癌等恶性肿瘤的化疗药，然而其治疗存在较大毒性，常发生迟发性腹泻及严重中性粒细胞减少症。研究表明个体UGT1A1基因多态性状态与伊立替康治疗不良反应密切相关。为优化临床伊立替康药物疗效的管理，国内越来越多的实验室开展了UGT1A1基因多态性检测。室间质量评价是UGT1A1基因多态性检测质量保证的重要内容。在本研究之前，中国UGT1A1基因多态性分型的室间质量评价尚为空白。为了提高临床实验室UGT1A1基因分型能力，本研究第一部分中以可模拟真实临床样本的UGT1A1基因多态性细胞系为质控品，将其用于实验室基因多态性检测室间质量评价，探讨该质控品的实用性和各临床实验室UGT1A1基因多态性分型能力。
　　制备的细胞质评样本由3种不同UGT1A1基因多态性的永生化人淋巴细胞系组成。首先对制备的细胞质评样本性能进行了验证分析，其稳定性及均一性符合室间质评样本的要求。采用PCR-Sanger测序法对不同基因型进行验证，结果与预期相符。随后将制备的该质评样本组成包括10支样本的室间质评样本盘，发放至全国45家临床实验室。共收到45份有效回报结果，检测结果完全正确实验室为97.7％(44/45);所有参评实验室检测的样本符合率为99.4％，仅一份假阴性结果，无假阳性结果;使用最多的检测方法是PCR-测序法(75.6％，34/45)，其中24份结果采用PCR-焦磷酸测序法检测。本研究第一部分成功运用含UGT1A1多态性的细胞样本进行全国室间质评，细胞样本较临床标本来源更稳定，异质性小，容易大量制备，可有效用于UGT1A1多态性基因分型检测室间质量评价。本次室间质量评价的结果表明，国内大多数UGT1A1基因分型实验室具备正确分型UGT1A1基因多态性的能力。
　　非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的EML4-ALK融合基因是化疗药物ALK激酶抑制剂—克唑替尼的分子靶标，而选择克唑替尼治疗的前提为准确和可靠地检测出ALK基因重排。目前荧光原位杂交(fluorescence in situhybridization，FISH)是临床EML4-ALK融合基因检测验证的标准方法，但存在价格昂贵，操作规范要求较高，检测周期长等缺点，因此EML4-ALK融合基因的检测方法仍有待改进。
　　本研究第二部分的目的是以CRISPR-Cas9(clustered regularly interspacedshort palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated easpase9(Cas9))技术平台为基础，利用核酸酶失活的Cas9(nuelease-deficient Cas9，dCas9)与sgRNA(singleguide RNA)组装后具有与靶序列结合而不对其切割的特点，将荧光标记的dCas9蛋白与靶向ALK基因的sgRNA分子体外组装为核酸探针，建立针对EML4-ALK基因重排检测的新方法，首次探讨该技术在临床分子诊断中的应用价值。本研究中，通过原核表达纯化dCas9蛋白，其中dCas9蛋白融合表达Halo标签，可采用多种Halo荧光配基实现对dCas9蛋白不同荧光标记。首先以端粒重复序列的检测对sgRNA/dCas9检测体系进行了验证及优化。通过设计端粒sgRNA，体外与dCas9蛋白组装后检测本研究中所用细胞系的端粒，结果显示端粒-sgRNA/dCas9复合物可成功检测体外固定细胞中染色体端粒。随后，以含串联重复序列的MUC4基因2号外显子及相邻3号内含子为靶点设计sgRNA，与两种不同荧光标记的dCas9蛋白分别组装，进一步验证了该方法进行双基因标记的能力。利用该检测体系对非小细胞肺癌EML4-ALK融合基因进行了检测。本研究中ALK为单拷贝基因，为提高荧光检测灵敏度，对ALK基因重排位点上下游各约5kb特异靶序列分别设计多条sgRNAs，组装两种荧光标记的dCas9蛋白后分别对肺癌EML4-ALK阳性细胞系及阴性细胞系进行ALK基因重排检测。初步结果显示，由于该检测体系加入多条sgRNA序列，荧光标记信噪比较重复序列检测低，结果观察不明显;对于EML4-ALK阳性的细胞系，可在少数细胞中观察到分离荧光信号的阳性结果;对于EML4-ALK阴性的对照细胞系，荧光重合点较预期结果少，需进一步优化检测条件。综上所述，基于CRISPR/dCas9系统的体外基因检测方法操作简便，省时，具有良好的应用前景。首次通过该检测方法初步探讨了其对非小细胞肺癌ALK基因重排的检测，结果显示该方法对ALK基因重排具有一定的检测能力，但仍需对方法学进行优化后进一步验证。
　　本研究的创新点主要有:
　　(1)探讨了细胞质评样本对UGT1A1基因多态性检测室间质量评价的可行性及实用性，结果证明该质评物质具有良好的实用性，国内大多数实验室具备正确分型UGT1A1基因多态性的能力。
　　(2)探讨了CRISPR/Cas9系统在体外检测细胞内融合基因的可行性，初步研究结果证明该方法对EML4-ALK融合基因具有一定的检测能力。

目录

声明

英文缩略词

摘要

第一部分 伊立替康药物代谢基因UGT1A1多态性检测室间质量评价研究

前言

1．材料和方法

1．1．实验材料和试剂配制

1．2．方法

2．结果

2．2．UGT1A1基因多态性细胞系基因型的验证

2．3．UGT1A1基因多态性检测室间质评样本基因型的验证及样本盘的构建

2．4．UGT1A1基因多态性检测室间质评样本均匀性和稳定性验证

2．5．以培养细胞作为质评样本的室间质量评价

3．讨论

参考文献

第二部分 基于CRISPR／Cas9系统检测非小细胞肺癌EML4-ALK融合基因的研究

前言

1．材料和方法

1．1．实验材料和试村配制

1．2．方法

2．结果

2．3．dCas9-Halo蛋白的表达、纯化及鉴定

2．4．sgRNA体外转录合成

2．5．荧光标记dCas9蛋白浓度测定

2．6．sgRNA／dCas9复合物标记功能验证

2．7 sgRNA／dCas9复合物对非小细胞肺癌细胞系ALK基因重排检测

2．8 H3122细胞染色体核型分析

3．讨论

参考文献

论文综述 Stepping toward to targeting therapeutic CRISPR in cancer：promising strategies and present challenges

附录

致谢

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