高通量测序法研究组蛋白H2A变体及H3K79me3修饰在小鼠精子发生过程的表观遗传变化

摘要

精子是雄性生殖细胞终末分化细胞，其染色体为实现精子功能，亦产生了特异的变化。与体细胞不同，精子染色体主要由DNA缠绕精蛋白组成，精子细胞核内DNA高度压缩，在哺乳动物的精子中，仅残留约5％-15％的组蛋白。在精子发生的过程中，精原细胞经过自身有丝分裂、初级精母细胞和次级精母细胞的减数分裂及精子形成过程实现精子的成熟。伴随该过程，精子染色体亦发生剧烈的特征性变化，在减数分裂阶段，染色质经历联会及两次减数分裂的过程，在精子形成过程，染色质经历组蛋白过渡蛋白替换、过渡蛋白精蛋白替换的过程，以上过程伴随着剧烈的表观遗传方面的变化。 本研究采用高通量测序的方法，尝试阐释在小鼠精子发生过程中组蛋白H2A变体在粗线期初级精母细胞及圆形精子细胞内的动态变化状态及其生物学功能，以及组蛋白修饰H3K79me3在粗线期出现的作用。 研究采用STA-PUT的方法，在小鼠睾丸中分离粗线期初级精母细胞及圆形精子;采用Native-ChIP的方法，对分离细胞进行建库。经高通量测序的数据，结合公共数据库报道的数据，采用生物信息学的方法，在基因定位、染色体定位及与转录水平关系的方面对组蛋白H2A变体在分离细胞中的分布进行研究;结合公共数据，对粗线期初级精母细胞中组蛋白修饰H3K79me3占位序列与其他修饰、变体间的占位相互关系及其与转录的关系和该修饰占位基因的功能等方面进行分析。 研究成功构建了组蛋白H2A变体H2A.Z、γH2A.X、macroH2A在粗线期及圆形精子阶段及H3K79me3在粗线期的Native-ChIP测序文库。首次以ChIP-seq的方法，即单核小体分辨率水平，描述了研究中涉及的各变体在粗线期和圆形精子细胞中分布和定位的情况及H3K79me3在粗线期染色体上的分布状况。研究发现，组蛋白H2A变体在所分离的细胞阶段在基因上的定位极为有限，且大部分分布于基因间隔区和内含子区，组蛋白H2A变体对圆形精子阶段性染色体转录再激活无直接作用，发现研究中涉及的组蛋白H2A各变体在分离细胞阶段的功能与转录调控无直接关系，可能参与染色质结构的组织和染色质重塑。此外发现，圆形精子阶段组蛋白变体间存在较强的共定位现象，提示在该阶段组蛋白H2A变体间存在较强的替换。另外，在精子发生体系中，采用生物信息分析的方法验证了H3K4me3与H3K79me3之间存在相互作用的结论，结合转录组数据，发现H3K79me3在粗线期的出现与转录激活相关，特别是与粗线期至圆形精子阶段的特异基因的转录激活相关，该发现不同于已有基于免疫荧光染色观察的发现。

目录

摘要

Abstract

前言

1．1染色质与表观遗传

1．2精子发生中表观遗传研究概况

1．2．1精子的染色质结构

1．2．2精子发生过程中的染色质变化

1．2．3精子发生过程中的组蛋白变体

1．2．4精子发生过程中的H3K79位甲基化的变化

1．3不同分化时期生精细胞分离方法

1．3．1不同日龄小鼠生精上皮细胞的组成

1．3．2生精细胞密度沉降原理

1．4本课题的研究目的、科学意义及技术路线

2．1．1试剂耗材

2．1．2仪器设备

2．1．3常用溶液

2．1．4分析软件

2．1．5公共数据

2．2实验方法

2．2．1小鼠生精细胞的分离与鉴定

2．2．2分离粗线期和圆形精子细胞的免疫荧光染色

2．2．4ChIP-seq测序文库的构建与质控

2．2．5ChIP-seq数据的分析

2．2．6RNA-seq数据的分析

结果

3．1小鼠生精细胞的分离

3．1．1分离所得粗线期初级精母细胞及圆形精子细胞的光镜检测

3．1．2分离所得粗线期初级精母细胞及圆形精子细胞的免疫荧光检测

3．2 ChIP实验结果

3．2．1染色质免疫共沉淀单核小体DNA的检测

3．2．2 ChIP-DNA建库情况的检测

3．3 RNA-seq的数据分析

3．4 H3K79me3的数据分析

3．4．1 H3K79me3在粗线期初级精母细胞中分布于TSS附近

3．4．2 H3K79me3在粗线期初级精母细胞中与H3K4me3共定位

3．4．3 H3K79me3与粗线期初级精母细胞基因活跃转录状态的改变相关

3．5 γH2A．X的数据分析

3．5．2 γH2A．X在粗线期及圆形精子的定位与基因转录变化无直接相关性

3．5．3 γH2A．X在粗线期及圆形精子细胞主要定位于基因间隔区及内含子

3．6 H2A．Z的数据分析

3．6．1粗线期及圆形精子H2A．Z在基因范围内的定位

3．6．2 H2A．Z的占位在粗线期及圆形精子与基因转录变化无直接相关性

3．6．3 H2A．Z在粗线期及圆形精子细胞主要定位于基因间隔区及内含子

3．7 macroH2A的数据分析

3．7．1 macroH2A在粗线期及圆形精子中在基因范围内主要定位于gene body上

3．7．2 macroH2A的占位基因在粗线期及圆形精子转录水平上无显著变化

3．7．3 macroH2A在粗线期及圆形精子细胞主要定位于基因间隔区及内含子

3．8 ChIP-seq数据综合分析

3．8．1粗线期及圆形精子阶段各修饰、组蛋白H2A各变体分布情况

3．8．2粗线期及圆形精子阶段各修饰、组蛋白H2A各变体的动态变化

3．8．3粗线期及圆形精子阶段各修饰、组蛋白H2A各变体占位基因的GO分析

总结

4．1粗线期H3K79me3修饰的研究

4．2粗线期和圆形精子阶段组蛋白H2A变体的研究

讨论

参考文献

英文名词及缩写

文献综述 精子发生中的表观遗传研究进展

致谢

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