缺磷胁迫导致高等植物叶片中磷脂酰甘油(PG)含量降低的机理研究

摘要

磷脂酰甘油(PG)是植物类囊体膜中唯一的磷脂，在它的sn-2位上总是连着一个棕榈酸(16:0)或反式十六碳烯酸(16：1 trans)。由于PG的分子结构独特，对它的功能已有了很多研究，目前认为PG在维持类囊体膜的结构与功能方面具有非常重要的作用。缺磷胁迫下，蓝藻、衣藻及拟南芥、大麦等物种中均检测到了PG含量的下降。对这一现象的常见解释是缺磷导致了PG生物合成受阻，从而引起了其含量的降低。但迄今为止尚没有试验证据支持。本研究比较了缺磷对不同叶龄的小麦与烟草叶片中PG含量与PG水解酶的活性的影响，同时对缺磷叶片酶粗提液水解外源PG后的主要产物、几种磷脂酶抑制剂对上述酶反应的影响等进行了研究，以阐明缺磷条件下叶片中PG含量下降的主要原因。
　　 缺磷小麦第一叶完全展开时，PG含量与PG水解酶活性均与对照相似；而第三叶完全展开时，尽管缺磷第三叶中PG水解酶活性也与对照相似，但其PG含量低于对照。这一结果表明，在小麦叶片完全展开之前，缺磷条件未影响叶片中的PG水解酶活性，第三叶中较低的PG含量应由PG的生物合成受阻引起。并且，由于缺磷植株第一叶完全展开时PG含量未受影响而第三叶中却表现出了轻微降低，可以推测叶片萌发越晚，PG生物合成受到的抑制就会越严重。
　　 为了研究叶片衰老过程中PG含量下降的原因，我们比较了6，10，14与18日龄时缺磷与对照小麦植株第一叶中PG的相对含量与PG水解酶活性。研究发现：6日龄时，刚刚完全展开的缺磷和对照小麦第一叶中无论是PG含量还是PG水解酶活性都较为相似；而随着叶片的逐渐衰老，缺磷植株第一叶中PG含量大幅度下降，同时伴随着PG水解酶活性的急剧上升。18日龄时，缺磷小麦第一叶中的PG含量较对照降低了69.1％，其PG水解酶活性也远高于对照，37℃下温育30min后，缺磷叶片的酶粗提液使外源PG含量降低了74.16％，而对照中只降低了13.7％。上述结果表明，缺磷条件下，小麦叶片中PG含量降低的程度与PG水解酶活性的强弱密切相关，PG水解加剧是导致老叶中PG含量降低的一个重要原因。
　　 磷脂酶是水解磷脂的主要酶类。目前在植物体中发现的磷脂酶种类主要有磷脂酶D(PLD)、磷脂酶C(PLC)与磷脂酶A(PLA)。通过薄层层析(TLC)，我们发现缺磷小麦叶片的酶粗提液水解外源PG后的主要产物是磷脂酸(PA)、二脂酰甘油(DAG)与游离脂肪酸(FFA)。将n-丁醇加入到缺磷小麦叶片的体外酶反应体系中后，观察到PA、DAG与FFA的生成量均表现出一定程度的降低。由于n-丁醇是PA经PLD途径生成的抑制剂，因此，上述结果表明PLD参与了缺磷条件下小麦叶片中PG的水解。硫酸新霉素是PLC的非特异性抑制剂，低浓度的硫酸新霉素(100μM和200μM)加入到缺磷小麦叶片的体外酶反应体系后，三种产物的生成受到了严重抑制，表明PLC也与缺磷叶片中PG的降解密切相关。
　　 为了进一步分析缺磷导致PG含量降低的原因，我们以烟草为试验材料，检测了缺磷胁迫对烟草嫩叶和老叶中的PG含量、PG水解酶活性、与PG降解相关的酶的种类及PLC、PLDα、PLDβ与PAT-1基因在mRNA上表达水平的的影响。结果表明，缺磷烟草叶片中PG含量的降低由PG生物合成受阻与PG降解加剧共同导致，PLC和PLD活性与烟草叶片中PG的降解有关。缺磷植株老叶中PG水解酶活性及PLC、PLDα、PLDβ基因在mRNA水平上的表达量均高于对照，表明在磷胁迫条件下，老叶中PG水解酶活性可能受到转录水平上的调节， PLC、PLDα、PLDβ转录活性的增强导致了PLC、PLD活性加强，从而引起PG降解的加剧，最终导致了PG含量的降低。与PLC、PLDα和PLDβ不同，缺磷胁迫对patatin蛋白(表现PLA2活性)的编码基因PAT-1在转录水平上的表达无影响，TLC分析PG的水解产物也未检测到溶血磷脂酰甘油(LPG)的生成。由此可见，PLA活性可能与缺磷条件下PG的降解无关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词表

第一章 引言

1.膜脂的组成和结构

2.膜脂的功能

2.1膜脂与类囊体膜中色素蛋白复合体的相互作用

2.2利用脂突变体的研究来确定脂的功能

2.3缺磷胁迫对膜脂的影响

3.本研究的目的和意义

第二章 缺磷胁迫对小麦地上部分膜脂组成的影响

1.前言

2.材料和方法

2.1实验材料

2.2膜脂的提取和分离

2.3甘油脂及其脂肪酸组成分析

2.4光合气体交换与PSⅡ最大光化学效率的测定

3.结果分析

3.1缺磷胁迫对小麦生长的影响

3.2缺磷胁迫对小麦地上部分膜脂组成的影响

3.3缺磷胁迫对MGDG、DGDG、PG与SQDG脂肪酸组成的影响

3.4缺磷胁迫对小麦光合气体交换与PSⅡ最大光化学效率影响

4.讨论

4.1缺磷引起小麦地上部分中PG含量下降，SQDG和DGDG含量上升

4.2缺磷胁迫未对四种甘油脂的脂肪酸组成造成显著影响

5.小结

第三章 缺磷胁迫导致PG含量降低的原因探讨

1.前言

2.材料和方法

2.1 PG水解酶活性的测定

2.2叶绿素含量的测定

2.3可溶性蛋白含量测定

3.结果分析

3.1缺磷胁迫对完全展开后的小麦第一叶膜脂组成的影响

3.2缺磷胁迫对完全展开后的小麦第一叶中PG水解酶活性的影响

3.3叶片刚刚完全展开时缺磷胁迫对小麦第一叶及第三叶膜脂组成的影响

3.4.叶片刚刚完全展开时缺磷胁迫对小麦第一叶及第三叶中PG水解酶活性的影响

4.讨论

4.1 PG降解是缺磷胁迫下导致小麦叶片中PG含量下降的一个重要原因

4.2 PG生物合成受阻是缺磷胁迫下导致小麦叶片中PG含量下降的另外一个重要原因

5.小结

第四章 缺磷条件下水解PG的主要酶种类鉴定

1.前言

1.1磷脂酶D

1.2磷脂酶C

1.3磷脂酶A2

1.4磷脂酶A1与磷脂酶B

1.5本研究的目的意义

2.材料与方法

3.结果分析

3.1 PG水解产物分析

3.2 n-丁醇对体外酶解反应的影响

3.3盐酸普萘洛尔对体外酶解反应的影响

3.4硫酸新霉素对体外酶解反应的影响

4.讨论

4.1磷脂酶D与缺磷小麦叶片中PG的降解有关

4.2磷脂酶C与缺磷小麦叶片中PG的降解有关

4.3磷脂酶A与缺磷小麦叶片中PG的降解的关系的探讨

5.小结

第五章 缺磷胁迫对烟草叶片中膜脂含量影响的研究

1.前言

2.材料方法

2.1试验材料

2.2 PG水解酶活性的测定

2.3 RNA提取及RT-PCR

3.结果分析

3.1缺磷胁迫对烟草嫩叶中脂类物质组成及PG水解酶活性的影响

3.2缺磷胁迫对烟草老叶中脂类物质组成及PG水解酶活性的影响

3.3 PG水解产物分析

3.4 n-丁醇对体外酶解反应的影响

3.5硫酸新霉素对体外酶解反应的影响

3.6缺磷胁迫对烟草嫩叶中几种磷脂酶转录水平的影响

3.7缺磷胁迫对烟草老叶中几种磷脂酶转录水平的影响

4.讨论

4.1缺磷条件下引起PG含量下降的原因

4.2 PLD和PLC与缺磷条件下烟草老叶中PG的降解有关

4.3缺磷胁迫影响了烟草叶片中PLDα、PLDβ、PLC及PAT-1的表达水平

5.小结

结论

参考文献

博士期间发表文章情况

致谢