磺酸基(SP)阳离子交换介质的制备及其对重组人乳铁蛋白的纯化

摘要

乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)是一种高附加值的药用蛋白质，人乳中含量较高，但因人乳来源有限，严重限制了其商业化应用。随着转基因技术的突飞猛进，LF已经在重组牛乳腺生物反应器中得到了高效表达。为了有效地利用该重组蛋白，本文首先采用进口SP离子交换介质为层析介质，建立了乳腺生物反应器表达的重组人乳铁蛋白分离纯化的规模化生产工艺，分离纯化工艺由牛奶预处理(Milkpretreatment)、离子交换层析(Ion Exchange Chromatography,IEC)、超滤脱盐(Ultrafiltration desalting)、冻干(Freeze drying)等步骤组成。批次处理量为200 L重组人乳铁蛋白牛奶，工艺所得产品约600 g纯品重组人乳铁蛋白，电泳及高效液相检测纯度大于95％。但是，由于本工艺采用价格高昂的进口离子交换介质，因此生产成本较高，限制了重组乳铁蛋白的应用。
　　 为了降低纯化工艺生产成本，本文以国产的快流速琼脂糖凝胶为基质合成了不同配基密度的SP离子交换介质，并成功应用于重组人乳铁蛋白的分离纯化。在琼脂糖凝胶活化步骤中，考察了烯丙基缩水甘油醚加入量、NaBH4用量、无水Na2SO4用量、反应时间、反应温度以及NaOH溶液的初始浓度等因素对介质烯丙基密度的影响。然后以Na2S2O5的磺酸基团为配基偶联烯丙基活化的琼脂糖凝胶，采用正交实验方法考察了Na2S2O5加入量、偶联缓冲液的pH值、反应温度对介质配基密度的影响。结果发现，影响介质配基密度的因素顺序为pH＞Na2S2O5加入量＞反应温度。通过反应过程的优化控制，可以实现SP离子交换介质上配基密度的控制并得到了高配基密度(0.24mmol/mL)的SP离子交换介质。
　　 最后，本文考察了研制的SP离子交换介质制备工艺的重现性、使用过程中介质的吸附性能。结果表明，自制介质合成工艺稳定、重复使用性与不同批次间的重现性较好，静态、动态吸附性能良好，不同配基密度的SP离子交换介质均可用于纯化出重组人乳铁蛋白。其中高配基密度(0.24 mmol/mL)的离子交换介质载量高达50 mL牛乳/mL介质，rHLF收率为86.5％，纯度为98.5％。圆二色谱结果表明纯化的rHLF结构与天然人乳铁蛋白一致。纯化所得的重组人乳铁蛋白的铁结合与释放活性与天然人乳铁蛋白相似，浓度为5 g/L的rHLF对大肠杆菌的生长具有明显的抑制作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

第一章 文献综述

1.1前言

1.2乳铁蛋白及其基因的研究进展

1.2.1乳铁蛋白的组织分布

1.2.2乳铁蛋白的结构

1.2.3乳铁蛋白基因的研究进展

1.3人乳铁蛋白的生理功能

1.3.1促进婴儿铁代谢

1.3.2抗微生物作用

1.3.3在炎症反应中的作用

1.3.4乳铁蛋白和癌症发生

1.3.5免疫调节功能

1.3.6 RNA酶活性

1.3.7蛋白酶活性

1.3.8转录调控功能

1.3.9 DNA结合

1.4人乳铁蛋白转基因研究进展

1.5人乳铁蛋白纯化方法的研究进展

1.5.1色谱法

1.5.2超滤法

1.5.3纯化乳铁蛋白方法的专利

1.6离子交换层析介质

1.6.1层析介质的发展概况

1.6.2离子交换层析介质的发展概况

1.7课题设计思想

第二章 从转基因牛乳中分离纯化人乳铁蛋白

2.1引言

2.2实验材料

2.2.1化学试剂

2.2.2仪器设备

2.3实验方法

2.3.1牛奶预处理

2.3.2离子交换层析

2.3.3脱盐及冻干

2.4分析方法

2.4.1蛋白质浓度检测

2.4.2 SDS-PAGE电泳检测

2.4.3高效凝胶过滤分析

2.5实验结果与讨论

2.5.1脱脂结果

2.5.2酸性沉淀

2.5.3离子交换层析

2.5.4超滤

2.6小结

第三章 磺酸基(SP)阳离子交换介质的制备

3.1引言

3.2实验材料

3.2.1化学试剂

3.2.2仪器设备

3.3实验方法

3.3.1 SP-琼脂糖凝胶6FF的制备过程(以自制快流速琼脂糖，6％为基质)

3.3.2 SP-琼脂糖凝胶6FF的制备过程(以不同白球为基质)

3.4分析方法

3.4.1烯丙基密度测定

3.4.2 SP配基密度测定

3.5实验结果与讨论

3.5.1自制快流速琼脂糖凝胶的活化

3.5.2自制快流速琼脂糖烯丙基活化胶偶联磺酸基

3.5.3 SP-琼脂糖凝胶配基密度的控制

3.5.4不同琼脂糖基质的SP离子交换介质的比较

3.6 小 结

第四章 SP离子交换介质性能的考察

4.1引言

4.2实验材料

4.2.1化学试剂

4.2.2仪器设备

4.3实验方法

4.3.1 SP离子交换介质的吸附性能评价

4.3.2目标蛋白质的分离-重组人乳铁蛋白的离子交换层析纯化

4.3.3重组人乳铁蛋白生化性质与生理功能的鉴定

4.4分析方法

4.4.1蛋白质浓度检测

4.4.2质谱鉴定

4.4.3高效凝胶过滤分析

4.4.4 SDS-PAGE电泳检测

4.4.5圆二色谱分析

4.5实验结果与讨论

4.5.1 SP离子交换介质的吸附性能

4.5.2 rHLF的分离纯化—SP离子交换介质分离性能评价

4.5.3纯化重组人乳铁蛋白的分子量测定

4.5.4纯化重组人乳铁蛋白的圆二色分析

4.5.5纯化重组人乳铁蛋白的生化性质与生理功能的鉴定

4.5.6介质合成工艺的重复性与介质的分离稳定性

4.6小结

第五章 结论与展望

5.1结论

5.2展望

参考文献

致 谢

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