混合固态发酵法生产β-木糖苷酶及其酶学性质研究

摘要

β-木糖苷酶是木聚糖酶系的重要组成成分，它以外切的方式作用于低聚木糖的非还原性末端，从而实现低聚木糖到木糖的转化。本课题首次使用黑曲霉和绿色木霉的诱变菌株进行混合固态发酵产β-木糖苷酶，并对固态发酵条件和所产β-木糖苷酶的酶学性质进行了深入研究。
　　 首先通过紫外诱变，菌种复筛和驯化手段，得到了遗传稳定的黑曲霉和绿色木霉的正突变菌株，产β-木糖苷酶能力分别提高了70％和50％。且发现混合发酵产酶要优于单菌株发酵，β-木糖苷酶活力提高了33％。混合发酵最适产酶条件:玉米芯和麸皮总质量为10g，质量比为1∶1，黑曲霉和绿色木霉接种体积比为2∶3，0.3mg·ml-1Ca2+，1％低聚木糖，35℃培养6d，可使酶活力达到最高，为0.25U·mg-1。用玉米芯和麸皮来进行固态发酵，降低了成本，具有环保和经济两方面的优势。
　　 β-木糖苷酶粗酶液经硫酸铵沉淀、热处理、SephadexG-100凝胶柱层析和DEAE-52阴离子交换柱层析纯化后，比酶活达到了21.85U·mg-1，β-木糖苷酶的回收率为14.5％，纯化倍数达到了91.0倍，纯化结果较好。对纯化后的酶进行了电泳，得出木糖苷酶的蛋白亚基分子质量在130kD左右。
　　 β-木糖苷酶酶学性质研究结果表明，该酶的最适合pH值为5.0，pH稳定范围为4.5-7.5，最适温度为45℃。对该酶活力有促进作用的离子有Ca2+、Na+、K+和EDTA，而Co2+、Cu2+、Ni+对该酶有很强的抑制作用。且该酶表现出良好的木糖耐受力和有机毒素耐受力。该酶酶解pNP-β-Xylopyranoside的Km值为0.051mmol·L-1，Vm值为0·41mmol·min-1·mg-1。该酶仅对pNP-β-Xylopyranoside有很好的酶解效果，具备很强的底物专一性。酶解条件实验证明了该酶与木聚糖酶之间存在良好的协同促进作用，混合酶解液可以将90％的木聚糖完全降解，且混合酶水解液中木糖含量要超过单一酶水解液50％。

目录

声明

学位论文数据集

摘要

第一章 绪论

1.1 本课题研究背景

1.1.1 木聚糖和木聚糖酶系

1.1.2 β-木糖苷酶的来源及类别

1.1.3 β-木糖苷酶的提纯

1.1.4 β-木糖苷酶酶活力检测方法

1.1.5 β-木糖苷酶的主要酶学性质

1.1.6 β-木糖苷酶的酶解机理和基因工程研究

1.1.7 β-木糖苷酶的应用研究

1.2 论文的创新性

1.3 本课题的研究内容、目的和意义

第二章 菌种选育

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 紫外诱变致死率

2.3.2 菌株筛选结果

2.3.3 菌株驯化结果

2.4 本章小结

第三章 混合固态发酵法生产β-木糖苷酶及发酵条件优化

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验材料

3.2.2 实验方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 标准曲线的制作

3.3.2 混合发酵和单菌株发酵的比较

3.3.3 混合发酵培养基的优化

3.3.4 发酵产酶曲线

3.4 本章小结

第四章 β-木糖苷酶的提取纯化及酶学性质研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 实验材料

4.2.2 实验方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 β-木糖苷酶纯化结果

4.3.2 β-木糖苷酶pH和温度性质

4.3.3 金属离子对β-木糖苷酶酶活的影响

4.3.4 β-木糖苷酶的木糖耐受力

4.3.5 β-木糖苷酶酶学动力学参数

4.4 本章小结

第五章 β-木糖苷酶酶解条件研究

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 实验材料

5.2.2 实验方法

5.3 结果与讨论

5.3.1 β-木糖苷酶底物特异性研究

5.3.2 底物浓度对酶解效果的影响

5.3.3 酶液量对酶解效果的影响

5.3.4 β-木糖苷酶和木聚糖酶的协同作用

5.3.5 纯化酶与粗酶液的酶解效果比较

5.3.6 挤压膨化玉米芯总液体量对酶解效率的影响

5.3.7 不同底物的酶解时间

5.3.8 低聚糖溶液中不同抑制物对酶解效率的影响

5.4 本章小节

第六章 结论

第七章 问题与建议

参考文献

附录

试剂与材料

仪器与设备

致谢

研究成果及发表的学术论文

作者及导师简介

硕士研究生学位论文答辩委员会决议书