液态发酵凝乳酶的工艺研究

摘要

凝乳酶是生产高质量奶酪的关键。由于牛犊胃中获得的皱胃酶受来源限制，供不应求，因此从植物或微生物中开拓新的来源，是近年研究的热点。以米黑毛霉液态发酵凝乳酶研发优质廉价的凝乳酶源，对乳制品的加工利用有重要意义。
　　 首先，对丝状真菌发酵产酶进行研究，发现米黑毛霉产凝乳酶活力最大，为21SU/mL，生长良好，确定作为可高产凝乳酶的潜力菌株。
　　 其次，用诱变方法选育得到产凝乳酶活力高且C/P值低的突变菌株米黑毛霉MmV-4，凝乳酶活力达40SU/mL，是原始菌株的2倍;C/P值为211，较原始菌株提高24％，且满足工业要求的低热稳定性。
　　 再次，对MmV-4菌株的发酵条件和培养基进行优化。初步选择蔗糖玉米浆培养基为液态发酵培养基，得到凝乳酶活力较固体麸皮培养基高2倍。沙氏培养基作孢子培养基较PDA培养基提高凝乳酶活力2倍，最优碳氮比为4∶1。发酵最优接种量为3％，发酵时间84h，发酵温度28℃。经发酵条件优化后，凝乳酶活力提高到60SU/mL，C/P值为280。蔗糖和玉米浆作碳氮源可诱导凝乳酶的合成，其中1.6％蔗糖和3％玉米浆对提高酶比活力、凝乳酶活性和C/P值显著。额外有机氮源添加对凝乳酶合成影响较大，其中0.5％胰蛋白胨和0.5％酵母粉+0.3蛋白胨对凝乳酶提高作用显著。0.2％磷酸氢二钠对凝乳酶活力和C/P值提高最大。重金属氯化锰对凝乳酶活力促进作用较大，硫酸锌的添加会降低凝乳酶活力和C/P值。最后，经响应面优化得到发酵培养基中显著性因子的最佳水平，提高凝乳酶活力达到399SU/mL，是优化前的20倍;C/P值为1425，是优化前的6.75倍，粗酶比活力390000SU/g。
　　 另外，对糯米酒曲发酵过程及优势菌株分离鉴定做了初步研究，得到一株产凝乳酶活力为2SU/mL的菌株B-1-4，为凝乳酶提供新的微生物来源。

目录

声明

学位论文数据集

摘要

符号说明

第一章 绪论

1.1 干酪的简介

1.1.1 干酪品种、起源及消费水平

1.1.2 干酪凝固机理

1.2 凝乳酶简介

1.2.1 凝乳酶生物来源研究进展

1.2.2 基因序列、一级结构与三维立体结构

1.2.3 凝乳酶理化性质及酶学性质研究进展

1.3 微生物发酵产凝乳酶研究现状

1.4 粗酶液中凝乳酶的分析方法

1.4.1 凝乳酶活力的测定

1.4.2 蛋白水解酶活性的测定

1.4.3 蛋白含量的测定

1.5 研究内容及目标

第二章 丝状真菌产凝乳酶生物特性的研究

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 菌株

2.2.2 试剂与设备

2.2.3 培养基

2.2.4 菌株的活化及发酵培养

2.2.5 测定方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 低浓度BSA标准曲线的绘制

2.3.2 发酵液pH与凝乳酶活力的变化

2.3.4 发酵过程蛋白含量的变化

2.4 小结

第三章 凝乳酶高产菌株的诱变选育

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 菌株

3.2.2 试剂与设备

3.2.3 培养基

3.2.4 孢子悬浮液的制备

3.2.5 分析方法

3.2.6 紫外(UV)诱变

3.2.7 亚硝酸诱变

3.2.8 优良突变株筛选

3.3 结果与讨论

3.3.1 确定诱变剂量

3.3.2 紫外诱变菌株筛选

3.3.3 亚硝酸诱变菌株筛选

3.3.4 凝乳酶耐热性复筛

3.3.5 突变株遗传稳定性试验

3.4 小结

第四章 发酵条件对产酶的影响

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 菌株及培养基

4.2.2 试剂与设备

4.2.3 生物量的测定方法

4.2.4 液态发酵培养基初步选择

4.2.5 孢子培养基对产酶的影响

4.2.6 不同接种量对产酶的影响

4.2.7 发酵时间对产酶的影响

4.2.8 不同温度对产酶的影响

4.3 结果与讨论

4.3.1 液态发酵培养基的初步选择

4.3.2 孢子培养基种类对产酶的影响

4.3.3 不同接种量对产酶的影响

4.3.4 发酵时间对产酶的影响

4.3.5 不同温度对产酶的影响

4.4 小结

第五章 产凝乳酶液态发酵培养基的优化

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 菌株及培养基

5.2.2 试剂与设备

5.2.3 分析方法

5.2.4 发酵培养基单因素的优化

5.2.5 重金属离子添加对产酶的影响

5.2.6 初始pH对产酶的影响

5.2.7 发酵培养基的中心组合实验设计

5.3 结果与讨论

5.3.1 蔗糖浓度对产酶的影响

5.3.2 玉米浆浓度对产酶的影响

5.3.3 氮源种类及浓度对产酶的影响

5.3.4 氯化钙浓度对产酶的影响

5.3.5 磷酸氢二钠浓度对产酶的影响

5.3.6 重金属离子添加对产酶的影响

5.3.7 初始pH对产酶的影响

5.3.8 发酵培养基的中心组合实验结果

5.4 小结

第六章 酒曲中筛选产凝乳酶菌株的初步研究

6.1 前言

6.2 材料与方法

6.2.1 菌株

6.2.2 试剂与设备

6.2.3 培养基

6.2.5 分析方法

6.2.6 酒曲中产凝乳酶菌株筛选

6.3 结果与讨论

6.3.1 酒曲发酵过程的研究

6.3.2 酒曲优势菌株的分离纯化及筛选

6.3.3 B-1-4菌株凝乳酶合成曲线

6.4 小结

第七章 结论与展望

7.1 主要结论

7.2 建议与展望

参考文献

附录

致谢

研究成果及发表的学术论文

作者和导师简介

硕士研究生学位论文答辩委员会决议书