红曲米液态发酵生产凝乳酶的方法

摘要

本发明涉及红曲米液态发酵生产凝乳酶的方法，属于生物工程和酶制剂制备技术领域。它采用红曲米的液态发酵，有机溶剂沉淀，低温离心方法，真空冷冻干燥，Sephadex G－75凝胶柱层析，DEAE－纤维素52层析的步骤。本发明通过低廉原材料制备出高活性的凝乳酶，可以极大地解决凝乳酶来源不足的问题。

说明书

【技术领域】

本发明涉及红曲米液态发酵生产凝乳酶的方法，属于生物工程和酶制剂制备技术领域。

【背景技术】

凝乳酶(chymosin，EC3.4.23.4)是一种从未断奶的小牛皱胃中发现的天门冬氨酸蛋白酶，其主要的生物学功能是有限剪切酪蛋白的κ-酪蛋白中Phe105-Met106连接的肽键，导致牛奶凝结，因此被广泛用于干酪制造业，成为食品领域中重要的酶制剂，其产值占全世界酶制剂的15％。

凝乳酶的传统制备方法是将出生10～30天的小牛屠宰，从其第四胃中用盐将凝乳酶浸提出来。由于凝乳酶是干酪生产中的关键性酶，随着世界干酪产业的不断发展，每年宰杀5000万头犊牛以获得凝乳酶的方法，仍不能满足生产的需要，也与现代化工业发展极不协调。因此，研究者都在不断寻找新的凝乳酶的来源，主要包括动物性凝乳酶、植物性凝乳酶及微生物源凝乳酶，但是这几种来源的凝乳酶又都具有一定的局限性。动物性凝乳酶受到来源限制，而且利用动物性凝乳酶生产的干酪不能满足素食主义者的需求。植物性凝乳酶虽然来源广泛，但是受到时间、地域、生长周期长，蛋白水解活性高等条件限制，很难发展。利用微生物生产凝乳酶是目前最有前途的发展方向，微生物生长周期短、产量大，受气候、地域、时间限制小，用其生产凝乳酶的成本较低、酶提取方便、经济效益高，但是同时也存在着微生物产生其它非酶类代谢产物的问题。一般微生物酶在成为商业用酶时，都要进行毒性、致癌性以及皮肤过敏性测试，因而真正用于工业化生产凝乳酶的菌株非常稀少。

红曲米是利用红曲霉生产，古称丹曲，是我国古代的伟大发明。多少年来，红曲不但用于酿酒，而且还应用于发酵食品、食品色素等方面。红曲一直用于我国传统食品豆腐乳的制作，它的安全性是确切有保证的。已经有研究证明红曲米发酵液作为凝乳剂是发酵液中的凝乳酶在发挥作用，红曲米发酵液中的凝乳酶是红曲米发酵液中微生物代谢产物，属于微生物源凝乳酶，由于红曲是我国传统的食品添加剂，所以从红曲米发酵液中提取的凝乳酶无需考虑微生物所产的非酶类代谢产物。利用液态发酵扩大生产，提高凝乳酶的活性具有重要的意义。

【发明内容】

本发明的目的是提供一种产高活性凝乳酶且可大批量生产的方法。主要工艺路线：利用红曲米，通过液态发酵改变培养基配方及发酵条件控制其代谢生产出凝乳活性较高的凝乳酶。

本发明技术方案如下：

红曲米液态发酵制备凝乳酶的方法，步骤如下：

1)红曲米粉碎成粉状，细度200—400目，将红曲米粉接种到PDA液态培养基中，28-30℃恒温培养90-96h，获得紫红色的红曲霉；红曲霉为紫红色，生长于红曲米的四周。

2)将红色的红曲霉接种至基础发酵培养基，28-30℃恒温培养12h进行扩大培养；

3)将步骤2)扩大培养后的红曲霉按5％(体积比)接种量加入到液体培养基中进行摇床培养，28-30℃，150r/min摇床培养70～72h，得到红曲霉活化液；

4)将步骤3)制得的红曲霉活化液按5％(体积比)接种量接种至发酵罐，通风量20～40L/min，培养温度28～32℃，转速200～350r/min，培养时间72～120h，发酵18h开始流加灭菌的液体培养基，流加速度为0.03L/h，制得红曲霉发酵液；

5)将步骤4)发酵的制得的红曲霉发酵液在4℃、4000r/min条件下离心10min，取上清液备用；

6)向步骤5)得到的上清液中分两次滴加2—3倍体积的乙醇进行醇沉，第一次4℃静置2h后，以7000r/min离心15min，保留沉淀；取上清液，用旋转蒸发仪浓缩后进行二次醇沉，条件为：4℃静置24h，以8000r/min离心15min，取沉淀；合并两次沉淀物，溶于pH6.2的磷酸缓冲液中，即为凝乳酶粗液；

7)使用Sephadex G-75凝胶柱层析纯化凝乳酶粗液，以pH6.2的磷酸缓冲液作为洗脱液，分步收集，检验收集液的活性，合并有活性的洗脱液；

8)利用DEAE-纤维素52对上述洗脱液进一步纯化，以pH7.2的磷酸盐缓冲液为起始缓冲液，采用NaCl梯度洗脱，分布收集，检测活性，合并有活性洗脱液，浓缩冻干得到高纯度的凝乳酶。

上述步骤2)中的基础发酵培养基组分如下，均为重量百分比：

葡萄糖为1～1.5％；蛋白胨为0.1～0.5％；KH₂PO₄为0.1～0.5％；K₂HPO₄为0.1～0.5％；酵母粉为0.1～0.2％；MgSO₄·7H₂O为0.02～0.08％；ZnSO₄·7H₂O为0.02～0.05％；余量为蒸馏水，pH为5.0～7.0。

上述步骤3)中的液体培养基组分如下，均为重量百分比：

小麦麸皮水解液为4～8％；硫酸铵为0.2～0.6％；KH₂PO₄为0.1～0.5％；K₂HPO₄为0.1～0.5％；MgSO₄·7H₂O为0.02～0.08％；ZnSO₄·7H₂O为0.02～0.05％；余量为蒸馏水，pH为5.0～7.0。

上述步骤6)中，第一次醇沉中使用的乙醇浓度为72％wt，第二次醇沉中使用的乙醇浓度为95％wt。

上述步骤8)中，所述利用NaCl梯度洗脱优选0.15mol/L、0.25mol/L、0.35mol/L、0.45mol/L和0.55mol/L NaCl浓度的缓冲液进行梯度洗脱。

上述试剂和培养基配方，如无特别说明，均为本领域常规试剂和培养基。

上述制得的凝乳酶活性测定方法为：利用Arima法，取5mL质量浓度为100g/L的脱脂乳溶液，45℃保温5min，备用。将供试菌株培养液滤去菌丝后，其滤液于7000r/min，4℃离心8min，取0.5mL上清夜加入保温的脱脂乳液，旋涡混合器上混合，准确记录从加入酶液到乳凝固的时间。凝乳酶酶单位定义为：40min将1mL质量浓度为100g/L的脱脂乳凝固的酶量即为1个索氏单位(U)。

计算公式为U＝(供试乳体积/酶的数量)×(2400/T)×D

式中：T为凝乳时间；D为稀释倍数。

本发明的有益效果：

1.采用液态发酵红曲米产凝乳酶，原料易得；

2.以PDA培养基作为发酵红曲米的培养基，操作简单，成本低廉；

3.通过对摇床发酵培养基及发酵条件的优化，提高了红曲米发酵液产凝乳酶的活力；

4.通过对提取纯化工艺的控制得到了高纯度，高活性的凝乳酶。

【具体实施方式】

下面结合实施例对本发明的方法作进一步说明，但不限于此。实施例中使用的红曲米为滨州市鑫路商贸有限公司销售，色价1000—3000u/g，水分小于8％，细度160—200目，其他指标：符合国家标准GB4926—1985的要求。Sephadex G-75凝胶柱上海贝基生物科技有限公司有售、DEAE-纤维素52北京华美生科生物技术有限公司有售。

实施例1

培养基的优化

1)碳源对凝乳酶活性的影响

选择葡萄糖、蔗糖、小麦麸皮、可溶性淀粉、麦芽糖为碳源进行实验。碳源的浓度为50g/L，培养基的其他配比见基础发酵培养基。在以小麦麸皮作为发酵的碳源时，凝乳酶的凝乳活性远远高于采用其他碳源时的，说明小麦麸皮很可能不仅仅对发酵微生物的生长做贡献，更重要的是对凝乳酶这一次级代谢产物的合成起到积极的作用，小麦麸皮的这种影响可能是小麦麸皮的成分复杂，而所产生的有机或无机的成分也较多，对红曲米发酵而言营养成分更加齐全，而且更有利于高活性凝乳酶这一次级代谢产物的生成。由此确定，小麦麸皮为最佳产凝乳酶达到碳源。其他碳源培养基中生成的凝乳酶的蛋白水解活性较高，可能于其组成有关。

培养基中不同浓度的小麦麸皮对红曲米液态发酵产凝乳酶的影响，分别选取了20，40，60，80g/L五个浓度水平，另外尝试小麦麸皮与葡萄糖的不同配比。通过考虑凝乳酶凝乳活性与其蛋白水解活性比之的高低，最终选择浓度为4％～8％添加量的小麦麸皮作为培养基的碳源。

2)氮源对产凝乳酶的影响

实验结果表明，不同氮源对凝乳酶的产量的影响因氮源的种类不同而有不同，凝乳酶活也有很大差异。在实验室的8种氮源中，四种有机氮源(蛋白胨、酵母粉、大豆粕、玉米浆)产凝乳酶的凝乳活性几乎都低于用四种无机氮源(硫酸铵，硝酸铵，氯化铵，硝酸钠)时产凝乳酶活性，且凝乳酶的蛋白水解活性也都较高，不适合干酪的生产。

硫酸铵作为氮源，凝乳酶活性高的原因主要是铵离子被利用后，硫酸根离子存在于发酵液中，可使发酵液保持在酸性。这种酸性可以使红曲米发酵处于更佳的状态。

3)培养基初始pH对凝乳酶活性的影响

红曲米的发酵过程中，发酵液大多数时间是处于酸性范围内，因此在弱酸性的培养基初始条件下，比较易于红曲米发酵，凝乳酶活性相对较高，随着pH值升高，凝乳酶活性逐渐降低。凝乳酶活性随着pH值升高而一直下降趋势。根据试验结果确定培养基的初始pH为6.0～7.0。

4)不同取样时间对凝乳酶活性的影响

在以上试验的基础上测定红曲米发酵液的凝乳酶活性，并作曲线，我们可以看出前三天发酵液凝乳酶活性随时间增长而快速增长，在3～5天左右处于平稳生产期。在5天后就急剧下降，由此可以看出凝乳酶属于红曲米发酵的一个次级代谢中间产物，因此我们取样时间取3～4天。

5)发酵条件的三水平四因素正交试验

选择碳源、氮源、起始pH、发酵时间为考察因素，其余成分同基础发酵培养基。

实验结果表明培养基起始pH对红曲米发酵产凝乳酶活性影响最大，其次是添加氮源浓度及发酵时间，而添加碳源的浓度在实验中的变化范围内的影响不明显。根据实验结果最佳因素水平为：起始pH值为6.0，硫酸铵2％，发酵时间为3.5天，小麦麸皮4％，以此作为本发明的最佳培养基配方。

发酵条件的优化

(1)发酵参数的优化

采用正交实验所得的最佳培养基配方，进行了10L发酵灌深层培养操作条件的优化。红曲米发酵是好氧发酵，因此溶氧量是一个重要的参数，它直接影响发酵产物尤其是次级代谢产物凝乳酶的产量。通过改变通风量与搅拌转速形成高、低两种不同水平的溶氧条件，考察红曲米发酵在这两种不同的溶氧条件下产凝乳酶的活性的情况，结果发现在低溶氧情况下，产凝乳酶活性最高峰时间明显滞后于高溶氧情况下，凝乳酶的而最终产量也明显低。可见溶氧量对红曲米发酵产生凝乳酶的影响是较大的。在实验的基础上最终确定出红曲米液态发酵产凝乳酶的最佳操作工艺条件为：通风量20～40L/min，培养温度28～32℃，转速200～350r/min，接种红曲米发酵液5％，培养时间72～120h。

(2)液态流加发酵，流加糊化的小麦麸皮对凝乳酶活性的影响

流加技术可以消除底物和产物的抑制作用。因此我们尝试了流加糊化的培养基的方法，以期提高凝乳酶的活性和产量。在以上实验基础上，采用有效装液量为7L的发酵罐，底液量为5L，发酵18h时开始进行流加操作，流加速度为0.03L/h，在此操作条件下，最终凝乳酶产量比间歇发酵时提高了18％，可见利用流加发酵液可以克服初始营养浓度过高而引起的对凝乳酶生长的抑制，有效地提高了凝乳酶的活性及原料利用率。最终发酵液的凝乳酶活性三灌平均稳定达到56U/mL.

凝乳酶的粗制

以上实验所得红曲米发酵液经4℃，3500r/min离心10min，取上清液。向其中缓缓加入3倍体积的72％wt的乙醇，4℃静置2h后4℃，7000r/min离心15min，保留沉淀；取上清液，真空浓缩后加3倍95％wt乙醇4℃静置8h，4℃，8000r/min离心15min，两次沉淀物合并溶解于pH6.25的磷酸缓冲液中，即为凝乳酶粗液。该粗液中蛋白含量为625.3mg，凝乳活力为151.6U/mg。进行真空冷冻干燥获得晶体凝乳酶产品，凝乳活力为2405.16U/mg。

首先利用使用Sephadex G-75凝胶柱层析纯化凝乳酶粗液，以pH6.2的磷酸缓冲液作为洗脱液，分步收集，检验收集液的活性，合并有活性的洗脱液；利用DEAE-纤维素52进一步纯化，以pH7.2的磷酸盐缓冲液为起始缓冲液，以含0.15mol/L、0.25mol/L、0.35mol/L0.45mol/L及0.55mol/L NaCl浓度的缓冲液进行梯度洗脱，分布收集，检测活性，合并有活性洗脱液，浓缩冻干得到高纯度的凝乳酶。纯化后冻干得到201.8mg凝乳酶，凝乳活力达4562.1U/mg，得到蛋白回收率为17.5％，酶活提高31倍。

实施例2

一种红曲米液态发酵制备凝乳酶的方法，步骤如下：

1)红曲米粉碎成粉状，细度400目，将红曲米粉接种到PDA斜面培养基，28℃恒温培养90h，获得紫红色的红曲霉；红曲霉为紫红色，生长于红曲米的四周。

2)将红色的红曲霉接种至基础发酵培养基，28℃恒温培养12h进行扩大培养；

基础发酵培养基组分如下，均为重量百分比：

葡萄糖为1.5％；蛋白胨为0.5％；KH₂PO₄为0.3％；K₂HPO₄为0.3％；酵母粉为0.2％；MgSO₄·7H₂O为0.04％；ZnSO₄·7H₂O为0.03％，余量为蒸馏水，pH为5.6。

3)将步骤2)扩大培养后的红曲霉按5％(体积比)接种量加入灭菌后的液体培养基进行摇床培养，30℃，150r/min摇床培养72小时，装液量100mL/500mL三角瓶，得到的红曲霉活化液；

液体培养基组分如下，均为重量百分比：

小麦麸皮水解液为6％；硫酸铵为0.3％；KH₂PO₄为0.5％；K₂HPO₄为0.2％；MgSO₄·7H₂O为0.05％；ZnSO₄·7H₂O为0.03％，余量为蒸馏水，pH为5.5。

4)将步骤3)制得的红曲霉活化液按照体积百分比比5％的接种量接种至发酵罐，发酵罐有效装液量7L，底液量为5L，通风量40L/min，培养温度28℃，转速200r/min，培养时间90h，发酵18h开始流加灭菌的液体培养基，流加速度为0.03L/h，制得红曲霉发酵液

5)将步骤4)发酵的得到的红曲霉发酵液在4℃、4000r/min条件下离心10min，取上清液备用；

6)向步骤5)得到的上清液中滴加3倍体积的72％wt乙醇进行醇沉，4℃静置2h后，以7000r/min离心15min，保留沉淀；取上清液，用旋转蒸发仪浓缩，然后滴加3倍体积的95％wt乙醇进行醇沉，4℃静置24h后，以8000r/min离心15min，取沉淀，合并两次沉淀物且溶于pH6.2的磷酸缓冲液中，即为凝乳酶粗液；

7)使用Sephadex G-75凝胶柱层析纯化凝乳酶粗液，以pH6.2的磷酸缓冲液作为洗脱液，分步收集，检验收集液的活性，合并有活性的洗脱液；

8)利用DEAE-纤维素52对上述洗脱液进一步纯化，以pH7.2的磷酸盐缓冲液为起始缓冲液，采用0.15mol/L、0.25mol/L、0.35mol/L、0.45mol/L和0.55mol/L NaCl梯度洗脱，分布收集，检测活性，合并有活性洗脱液，浓缩冻干得到高纯度的凝乳酶。经检测凝乳酶活力达4562.1U/mg。

实施例3：

一种红曲米液态发酵制备凝乳酶的方法，步骤如下：

1)红曲米粉碎成粉状，细度200目，将红曲米粉接种到PDA斜面培养基，30℃恒温培养96h，获得紫红色的红曲霉；红曲霉为紫红色，生长于红曲米的四周。

2)将红色的红曲霉接种至基础发酵培养基，30℃恒温培养12h进行扩大培养；

基础发酵培养基组分如下，均为重量百分比：

葡萄糖为1.5％；蛋白胨为0.4％；KH₂PO₄为0.3％；K₂HPO₄为0.4％；酵母粉为0.15％；MgSO₄·7H₂O为0.05％；ZnSO₄·7H₂O为0.02％，余量为蒸馏水，pH为6.0。

3)将步骤2)扩大培养后的红曲霉按5％(体积比)接种量加入灭菌后的液体培养基进行摇床培养，30℃，150r/min摇床培养70小时，装液量100mL/500mL三角瓶，得到的红曲霉活化液；

液体培养基组分如下，均为重量百分比：

小麦麸皮水解液为8％；硫酸铵为0.5％；KH₂PO₄为0.4％；K₂HPO₄为0.4％；MgSO₄·7H₂O为0.02％；ZnSO₄·7H₂O为0.02％，余量为蒸馏水，pH为6.5。

4)将步骤3)制得的红曲霉活化液按照体积百分比为6％的接种量接种至发酵罐，发酵罐有效装液量7L，底液量为5L，通风量20L/min，培养温度30℃，转速350r/min，培养时间120h，发酵18h开始流加灭菌的液体培养基，流加速度为0.03L/h，制得红曲霉发酵液

5)将步骤4)发酵的得到的红曲霉发酵液在4℃、4000r/min条件下离心10min，取上清液备用；

6)向步骤5)得到的上清液中滴加3倍体积的72％wt乙醇进行醇沉，4℃静置2h后，以7000r/min离心15min，取上清液，用旋转蒸发仪浓缩，然后滴加3倍体积的95％wt乙醇进行醇沉，4℃静置24h后，以8000r/min离心15min，取沉淀，溶于pH6.2的磷酸缓冲液中，即为凝乳酶粗液；

7)使用Sephadex G-75凝胶柱层析纯化凝乳酶粗液，以pH6.2的磷酸缓冲液作为洗脱液，分步收集，检验收集液的活性，合并有活性的洗脱液；

8)利用DEAE-纤维素52对上述洗脱液进一步纯化，以pH7.2的磷酸盐缓冲液为起始缓冲液，采用0.15mol/L、0.25mol/L、0.35mol/L、0.45mol/L和0.55mol/L NaCl梯度洗脱，分布收集，检测活性，合并有活性洗脱液，浓缩冻干得到高纯度的凝乳酶。经检测凝乳酶活力达4572.9U/mg。