发酵重组大肠杆菌产（+）γ-内酰胺酶及酶的固定化研究

摘要

(-)γ-内酰胺是一种重要的化学中间体，主要可以用来制备阿巴卡韦和帕拉米韦等药物。
　　本文主要研究内容为重组大肠杆菌发酵生产(+)γ-内酰胺酶的条件优化以及(+)γ-内酰胺酶的固定化方法研究。
　　我们在15L发酵罐中通过对不同培养条件的实验比较，最终成功探索出一种适合于重组大肠杆菌生长产(+)γ-内酰胺酶的方法——双程培养双程诱导法，即在37℃下培养菌种至对数生长期开始时升温至42℃培养至放罐，在对数期结束后加入乳糖进行诱导约6h后加入等量乳糖再诱导一次，经过重复实验反复比较发现此法发酵所得(+)γ-内酰胺酶酶量最大。全细胞转化实验表明:0.16g湿菌体在50℃下反应1h催化2ml，5g/L的（±）γ-内酰胺ee值可达95％以上，此结果可以满足工业化生产需求。
　　以离子交换树脂和氨基树脂（HA树脂）为固定化载体对酶的固定化进行了研究，结果表明:离子交换树脂在200g/L的高浓度底物反应下酶容易脱落，固定化酶重复使用次数较少且产物收率较低;HA树脂则呈现出较好的固定化效果，其酶活可达1200 U/g。对HA树脂为载体的固定化条件进行了研究，优化后的最佳条件为:交联温度30℃，戊二醛浓度4％，交联时间为2h，在此交联条件下树脂完成固定化反应后载酶量达到最大;最佳固定化条件为在30℃下固定化6h树脂载酶量可达最大。固定化后酶的Km值从3.93g/L升高到14.54g/L，Vmax从0.89g/L*min下降到0.63g/L*min;最适温度保持不变均为80℃，固定化后耐热性有所下降;最适pH保持不变均为8.0，固定化后pH耐受性大幅增强，在4-10的pH范围酶活几乎不受影响;进一步研究发现固定化后酶的表观活化能从40.03kJ/mol降低到33.61 kJ/mol，实验说明固定化酶的反应不是受酶动力学的影响而是受到传质影响。重复实验显示50次反应后仍然有50％的酶活剩余，该结果可以满足工业化生产要求。
　　本文还研究了新型固定化酶载体的制备及其运用。通过环氧氯丙烷与氧化石墨烯反应，对氧化石墨烯的羧基进行环氧化，研究结果表明修饰后的氧化石墨烯载体具有良好的应用前景。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 微生物发酵研究进展

1．1．1 酶和酶催化的简介

1．1．2 发酵简介及研究进展

1．2 (+)γ-内酰胺酶的介绍

1．3 固定化酶的研究进展

1．3．1 固定化简介

1．3．2 酶固定化方法研究进展

1．3．3 酶固定化载体研究进展

1．4 课题研究的目的、意义和内容

1．4．1 课题研究的目的和意义

1．4．2 课题研究的内容

第2章 重组大肠杆菌发酵产(+)γ-内酰胺酶的条件优化

2．1 引言

2．2 本章主要研究内容

2．3 实验仪器及材料

2．4 实验方法

2．4．1 种子培养基和发酵培养基配方

2．4．2 实验相关参数检测

2．4．3 摇瓶接种方法和罐上接种方法

2．4．4 发酵罐上调控方法

2．4．5 菌种复壮方法

2．4．6 绘图方法

2．5 实验结果及讨论

2．5．1 摇瓶发酵鉴定菌种及复壮实验结果

2．5．2 摇瓶工艺发酵罐上放大培养

2．5．3 恒定溶氧发酵

2．5．4 恒温37℃发酵

2．5．5 恒温30℃培发酵

2．5．6 37℃培养42℃诱导

2．5．7 增加卡那霉素浓度

2．5．8 乳糖量加倍

2．5．9 对数期开始时降温至30℃

2．5．10 对数期开始时升温至42℃

2．5．11 对数期开始时升温后双诱导

2．6 本章小结

第3章 HA树脂固定化(+)γ-内酰胺酶研究

3．1 引言

3．2 本章主要研究内容

3．3 实验仪器与药品

3．4 实验方法

3．4．1 HA树脂清洗

3．4．2 酶液制备

3．4．3 戊二醛交联方法

3．4．4 固定化酶制备方法

3．4．5 固定化酶酶活测定方法

3．4．6 交联、固定化条件优化研究方法

3．4．7 固定化酶催化反应条件的优化

3．4．8 酶学性质研究方法

3．4．9 固定化酶的表征方法

3．5 实验结果及讨论

3．5．1 戊二醛交联条件优化结果

3．5．2 固定化优化条件结果

3．5．3 反应条件优化

3．5．4 酶学性质研究结果

3．5．5 固定化酶的表征结果

3．6 本章小结

第4章 离子交换树脂固定(+)γ-内酰胺酶研究

4．1 引言

4．2 本章主要研究内容

4．3 实验仪器与药品

4．4 实验方法

4．4．1 离子交换树脂的清洗方法

4．4．2 酶液的制备方法

4．4．3 固定化酶的制备原理和方法

4．4．4 固定化酶酶活的测定方法

4．4．5 载体筛选和固定化条件优化方法

4．4．6 酶学性质研究方法

4．4．7 固定化酶表征方法

4．5 实验结果及讨论

4．5．1 树脂筛选结果

4．5．2 固定化温度实验结果

4．5．3 固定化时间实验结果

4．5．4 酶学性质实验结果

4．5．5 固定化酶的表征结果

4．6 本章小结

第5章 功能化氧化石墨烯固定化(+)γ-内酰胺酶研究

5．1 引言

5．2 本章主要研究内容

5．3 实验仪器与药品

5．4 实验方法

5．4．1 氧化石墨烯的制备

5．4．2 氧化石墨烯羧基修饰方法

5．4．3 固定化酶制备

5．4．4 酶学性质研究

5．4．5 固定化酶表征

5．5 实验结果及讨论

5．5．1 固定化酶红外表征结果

5．5．2 固定化酶耐热性实验结果

5．5．3 固定化酶重复实验结果

5．5．4 固定化酶酶学性质实验结果

5．6 本章小结

第6章 总结与展望

参考文献

附录

作者及导师简介

致谢