大肠杆菌生物合成水杨酸

摘要

水杨酸在医药和化妆品行业有重要的应用，而粘糠酸则是塑料和多种化学品生产的重要前体化合物。传统的的生产模式在生产水杨酸和粘糠酸的过程中都会造成不可再生资源的消耗和环境污染，在这样的大背景下，新绿色生物合成的生产方式给当代发展带来了希望。本实验阐述了利用微生物大肠杆菌作为宿主生物合成水杨酸和粘糠酸的菌株构建和优化过程。在实验室之前的生物合成粘糠酸和水杨酸的研究基础，采用了RED基因重组的方法在大肠杆菌ATCC31884菌株的基因组上建立了一个水杨酸的高产平台。
　　首先选取了不同强度启动子将合成水杨酸的基因整合到宿主细胞基因组上，通过莽草酸途径生产水杨酸，并找到了最优的菌株进行下一步优化;然后敲除了水杨酸生产途径的竞争途径，使水杨酸的产量增加一倍;再自下而上加强水杨酸的上游途径，为上游基因替换了强启动子之后发现水杨酸的产量是加强前的两倍;最后将菌株的水杨酸生产与细菌自身代谢生长相偶联。一步步的优化水杨酸的产量，最终得到水杨酸的摇瓶发酵产量为1.51g/L。并利用该水杨酸高产平台发酵粘糠酸，得到粘糠酸摇瓶产量为2.6g/L。
　　本实验与已经报道的大肠杆菌生产水杨酸的方法不同，在水杨酸高产平台的构建中，抛弃了质粒构建的方法，直接采用了在大肠杆菌的基因组上重组合成水杨酸的基因，使得到的水杨酸高产菌株更为稳定，由此高产平台发酵下游产物也更加的方便简单。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 合成生物学

1．2 莽草酸途径

1．2．2 莽草酸途径中的酶

1．3 水杨酸

1．3．1 水杨酸的性质

1．3．2 水杨酸的应用

1．3．3 水杨酸的生产方式

1．4 粘糠酸

1．4．1 粘糠酸的性质

1．4．2 粘糠酸的应用

1．4．3 粘糠酸的生产方法

1．5 RED基因重组

1．6 立题的目的及意义

1．7 本论文的研究内容

第二章 常规实验方法

2．1 仪器

2．2 试剂

2．4 基因组提取

2．5 质粒提取

2．6 PCR

2．6．1 克隆PCR

2．6．2 验证PCR

2．6．3 Overlap PCR

2．7 琼脂糖凝胶电泳

2．8 DNA产物的胶回收

2．9 酶切

2．10 连接

2．11 转化

2．11．1 化学转化

2．11．2 电转化

2．12 目的蛋白的表达

2．13 细胞破碎

2．14 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2．15 OD600测定细胞浓度

2．16 HPLC测定方法

2．16 RED重组进行基因整合

第三章 大肠杆菌生物合成水杨酸的菌株构建与产量优化

3．1 引言

3．2 T7RNA聚合酶基因的整合

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．2．3 实验结果

3．2．4 分析与讨论

3．3 水杨酸异源基因的整合

3．3．1 实验材料

3．3．2 实验方法

3．3．3 实验结果

3．3．4 分析与讨论

3．4 水杨酸竞争途径的敲除

3．4．1 实验材料

3．4．2 实验方法

3．4．3 实验结果

3．4．4 分析与讨论

3．5 水杨酸上游途径的加强

3．5．1 实验材料

3．5．2 实验方法

3．5．3 实验结果

3．5．4 分析与讨论

3．6 水杨酸的代谢偶联

3．6．1 实验材料

3．6．2 实验方法

3．6．3 实验结果

3．6．4 分析与讨论

3．7 小结

第四章 大肠杆菌生物合成粘糠酸的产量优化

4．1 前言

4．2 粘糠酸的质粒发酵

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验方法

4．2．3 实验结果

4．6 小结

第五章 结论与展望

参考文献

附录

致谢

作者和导师简介