肺炎克雷伯氏杆菌代谢产物3-HP的分离

摘要

3-羟基丙酸（3-HP）作为商业价值巨大的大宗化学品，应用十分广泛。目前市面上生产3-HP的方法常见于化学法和微生物法。化学合成法由于产量低、成本高、分离纯化难等缺点，工业化受到局限。微生物法合成3-HP的不断突破克服了化学合成法中存在的缺陷。本文以肺炎克雷伯氏杆菌（Klebsiella pneumoniae）作为发酵菌株，上罐发酵，得到了3-HP的发酵液。以3-HP发酵液为原料，初步建立了3-HP的分离路线。具体结果如下:
　　(1)根据3-HP的产量、时空产率、甘油转化率等指标，确认实验室已构建成功的高产3-HP的菌株K.pneumoniae(3tac)适用于上罐发酵和后期分离。发酵液各组分浓度如下所示:3-HP90.01g/L，乳酸7.36g/L，乙酸13.31g/L，1，3-丙二醇2.82g/L，2，3-丁二醇2.47g/L。
　　(2)用CaCl2作为絮凝剂，除去3-HP发酵液中的菌体和大分子蛋白等副产物。在最优的絮凝条件下，菌体的絮凝率达到99.99％，可溶性蛋白的絮凝率为90.98％，3-HP的损失率为1.6％。通过测定不同条件下的zeta电位和不同pH下的发酵液状态，初步确定CaCl2絮凝菌体的主要机理为电位中和。
　　(3)用粉末活性炭进行静态脱色，发现pH7，脱色剂用量达到28g/L时，色素的去除率为90％，3-HP的损失在5％-8％。用颗粒活性炭作为脱色材料，综合除杂效果和3-HP的损失，发现1.34mL/min可作为动态柱法的理想流速。732阳离子树脂不适用于3-HP发酵液的脱色。
　　(4)筛选了发酵液脱盐所用的树脂，结果表明732阳离子树脂和D301R阴离子树脂是性能优良的脱盐材料。732阳离子树脂的理想体积流量为2BV/h，D301R阴离子树脂的理想体积流量为1-2BV/h。利用711阴离子树脂和D290阴离子树脂除去醇类杂质，
　　(5)尝试使用薄层层析色谱法分离3-HP和乳酸，以1∶10的甲醇∶二氯甲烷为展开剂，分离出少量3-HP的纯品。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 3-HP概述

1．1．1 3-HP简介

1．1．2 3-HP合成方法总结

1．2 生物法生产3-HP的分离提取

1．3 絮凝除杂

1．3．2 絮凝剂分类

1．3．3 絮凝影响因素

1．4 发酵液中色素的去除

1．5 树脂脱盐法

1．5．1 离子交换树脂的结构

1．5．2 离子交换树脂的种类

1．5．3 离子交换树脂的交换原理

1．5．4 离子交换树脂的吸附选择性

1．5．5 发酵液除盐研究进展

1．6 同分异构体的分离研究进展

1．6．1 沸石膜分离

1．6．2 金属有机框架(MOF)

1．6．3 结晶

1．6．4 手性制备色谱

1．6．5 其他

1．7 课题背景和研究意义

1．8 研究内容

第二章 3-HP发酵优化及代谢产物确定

2．1 实验材料

2．1．1 菌种和载体

2．1．2 主要试剂及仪器

2．1．3 培养基配方

2．2 实验方法

2．2．3 发酵液中甘油浓度的测定

2．2．4 有机酸及醇类物质的测定

2．2．5 标准曲线的测定

2．3 结果与讨论

2．3．1 筛选高产3-HP的工程菌

2．3．2 发酵过程中K．pneumoniae的生物量变化

2．3．3 发酵过程中甘油消耗速率的变化

2．3．4 发酵周期中有机酸浓度的变化

2．3．5 标准曲线的测定

2．4 结论

第三章 3-羟基丙酸发酵液的絮凝

3．1 引言

3．2 实验材料

3．3 实验方法

3．3．1 发酵液中可溶性蛋白浓度的测量

3．3．2 发酵液的絮凝

3．3．3 菌体zeta电位的测定

3．3．4 发酵液在细胞成像多功能检测系统下的状态

3．3．5 扫描电镜制样过程

3．3．6 分析与表征

3．4 结果与讨论

3．4．1 可溶性蛋白标准曲线的测定

3．4．2 pH对3-HP发酵液絮凝的影响

3．4．3 CaCl2用量对3-HP发酵液絮凝的影响

3．4．4 搅拌转速对3-HP发酵液絮凝的影响

3．4．5 正交实验探究最佳絮凝工艺

3．4．6 CaCl2絮凝菌体和可溶性蛋白机理的探究

3．5 结论

第四章 3-羟基丙酸发酵液的脱色

4．1 引言

4．2 实验材料

4．3 实验方法

4．3．1 732阳离子树脂的预处理

4．3．3 色素的脱除

4．4 分析与表征

4．4．1 3-HP损失率的测定

4．4．2 脱色率的测定

4．5 结果与讨论

4．5．1 发酵液中色素的吸收波长的测量

4．5．2 以粉末活性炭作为脱色剂进行色素脱除

4．5．3 颗粒活性炭的脱色实验

4．5．4 732阳离子树脂的脱色实验

4．6 结论

第五章 离子交换法去除发酵液中的无机盐

5．1 引言

5．2 实验材料

5．3 实验方法

5．3．1 树脂预处理

5．3．2 阳离子除盐树脂的筛选

5．3．3 阴离子树脂的筛选

5．3．4 动态柱法优化除盐的体积流速

5．3．5 除盐树脂的再生实验

5．3．7 Cl-的测定

5．3．8 3-HP和醇类物质的静态吸附实验

5．4 结果与讨论

5．4．1 阳离子除盐树脂的筛选结果

5．4．2 动态柱法优化过程参数

5．4．3 732树脂的再生

5．4．4 阴离子除盐树脂的筛选结果

5．4．5 动态柱法优化阴离子树脂除盐的过程参数

5．4．6 D301R阴离子树脂的再生

5．4．7 离子交换法吸附3-HP

5．5 结论

6．1 引言

6．2 实验材料

6．3 实验方法

6．3．1 点样

6．3．2 展开

6．3．3 样品处理

6．3．4 柱层析过程

6．4 结果与讨论

6．4．1 显色剂的确定

6．4．2 展开剂的选择

6．4．3 柱层析色谱的液相图

6．5 结论

第七章 总结与展望

7．1 总结

7．2 展望

参考文献

致谢

研究成果及发表学术论文

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