肺炎克雷伯氏杆菌与大肠杆菌代谢调控及转录传感元件的研究

摘要

3-羟基丙酸（3-HP）为非手性有机酸，化学性质活跃，可转化为一系列重要化合物，且具有化学变通性。目前，商业化生产3-HP多为化学合成法，成本高、转化率低、分离纯化难度大，使得其生产方法亟待完善。微生物法产3-HP具有成本低和污染少等优势。随着合成生物学的发展，微生物生产3-HP引起人们关注。然而，微生物产3-HP的模式化生产仍然存在挑战。3-HP的研究需从多方面提高其产量和底物转化率，比如代谢调控、转录调控等。为此，本实验对肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)与大肠杆菌(Escherichia coli)的代谢调控及转录传感元件进行了研究。本实验设计与工作包括以下三方向内容:
　　1.K.pneumoniae中转录传感元件与pk启动子相互作用的研究。考察了RNA聚合酶的σ因子与甘油脱水酶pk启动子的亲和性，旨在增强3-HP合成基因的转录表达，提高3-HP的产量。实验筛选了3个sigma因子rpoE、rpoS、dksA并对其进行超表达。引入卡那霉素抗性基因的启动子Pkana以排除甘油脱水酶自身的pk启动子对此3个因子超表达的干扰，采用绿色荧光蛋白基因（gfp）以验证表达量的强弱。结果发现，rpoE的表达增强了pk启动子的效率。于是将醛脱氢酶的基因ald4替换gfp，得到重组菌K.pneumoniae(pET-pk-ald4-pkana-rpoE)。酶活和SDS-PAGE分析发现，ald4的酶活所提高，SDS-PAGE中显示ald4的表达条带。摇瓶发酵结果显示，重组工程菌K.pneumoniae(pET-pk-ald4-pkana-rpoE)的3-HP产量是对照组K.pneumoniae(pET-pk-ald4)的1.6倍。上罐发酵
　　TQ921.7
　　Q819
　　结果表明，重组菌K.pneumoniae(pET-pk-ald4-pkana-rpoE)的3-HP和1，3-丙二醇(1，3-PD)的转化率分别为0.105 mol/mol和0.34 mol/mol，总转化率为0.445 mol/mol。3-HP和1，3-PD的产量得以显著提高。因此，rpoE和pk启动子的适配性更高，提高了pk启动子的转录效率，促进了后续基因的转录翻译。
　　2.E.coli和K.pneumoniae的共培养研究。构建出携带不同抗性的K.pneumoniae与E.coii，以辨别并探究两菌的混菌体系。因此，克隆了E.coli中的cm基因，构建了重组工程菌E.coli(pET-cm)和K.pneumoniae(pET-28a)。E.coli(pET-cm)携带氯霉素和卡那霉素双重抗性，而K.pneumoniae(pET-28a)只携带卡那霉素抗性。考察了K.pneumoniae与E.coli单独培养和共培养的相对菌落数及存活率，结果显示，共培养中E.coli受到的生长抑制比K.pneumoniae更大，K.pneumoniae为共培养中的优势菌种。
　　3.针对K.pneumoniae中3-HP代谢分向的研究。弱化K.pneumoniae中产3-HP的副产物途径，降低或消除其中一些副产物对3-HP的影响。本实验设计以提高3-HP的产量为前提，探究3-HP代谢流之间的相互关系。实验涉及K.pneumoniae甘油途径中的八个相关酶基因:pmd(KPN01632)、poxB(KPN00904)、frdB(KPN04552)、fumC(KPN01517)、dhaT(KPN03491)、ilvH(KPN00083)、adhP(KPN01853)和pflB(KPN00931)。分别敲除了以上8个酶基因，弱化了八条代谢分支途径，构建了八株单基因敲除工程菌。对8株单基因敲除工程菌途径代谢物进行检测，分析单基因敲除工程菌中代谢流的变化，筛选出高产3-HP的工程菌。此外，对筛选出的最合适的两种酶基因进行组合敲除，测定组合敲除菌途径中代谢物的变化。在组合敲除菌中导入高产3-HP重组质粒tac-puuC，分析代谢物产量。由8株单基因敲除工程菌的摇瓶发酵结果可知，K.pneumoniae（△adhP）、K.pneumoniae(△pflB)的3-HP和1，3-PD相对产量较高，更适合做多基因敲除的表达宿主。由组合敲除菌的摇瓶和上罐发酵结果可知， K.pneumoniae△adhP△pflB(tac-puuC)在60 h时3-HP的产量达到了66.91 g/L，1，3-丙二醇的产量达到了3.85 g/L。此外，该重组菌K.pneumoniae△adhP△pflB(tac-puuC)的乳酸产量最高只为19.40 g/L，副产物的产量降低至对照组的1/3。该菌是生产3-HP的理想菌株。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 3-HP简介

1．2 3-HP的合成方法

1．2．1 化学合成

1．2．2 生物合成法

1．3 K．pneumoniae与E．coil

1．4 混菌体系概述

1．5 RNA聚合酶在转录调控方面的研究

1．5．1 RNA聚合酶概述

1．5．2 转录调控元件的研究

1．5．3 基于σ因子转录调控在改进细胞表型方面的研究

1．6 代谢调控概述

1．7 合成生物学方法

1．8 基因敲除技术

1．8．1 RecA系统

1．8．2 Red重组系统

1．8．3 ZFN技术和TALEN技术

1．8．4 CRISPR技术

1．9 立项意义

第二章 基于σ因子转录调控在改进细胞表型方面的研究

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 菌株、培养基和培养条件

2．2．2 基因和重组质粒

2．2．3 实验仪器和试剂

2．3 实验方法

2．3．1 重组菌的构建

2．3．2 绿色荧光蛋白分析

2．3．3 酶活分析

2．3．4 摇瓶和上罐发酵

2．3．5 SDS-PAGE分析

2．3．6 代谢物分析方法

2．4 结果与讨论

2．4．1 K．pneumoniae基因组的提取

2．4．2 GFP、Pkana、rpoE、rpoS、dksA及ald4基因的克隆

2．4．3 GFP、Pkana、rpoE、rpoS、dksA及ald4基因的连接转化

2．4．4 流式细胞仪检测GFP表达量

2．4．5 重组菌的ALD4酶活分析

2．4．6 SDS-PAGE分析

2．4．7 摇瓶发酵分析

2．4．8 K．pneumoniae(pET-pk-ald4-pkana-rpoE)上罐发酵的研究

2．5 本章小结

第三章 大肠杆菌和肺炎克雷伯氏杆菌的共培养研究

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 菌株、培养基和培养条件

3．2．2 基因和重组质粒

3．2．3 实验仪器和试剂

3．3 实验方法

3．3．1 重组菌的构建

3．3．2 重组工程菌的培养

3．3．3 分析测定

3．4 结果与讨论

3．4．1 工程菌E．coli(pET-cm)和K．pneumoniae(pET-28a)的构建

3．4．2 共培养和单独培养菌体生物量的分析

3．4．3 菌落数的测定

3．5 本章小结

第四章 肺炎克雷伯氏杆菌中3-羟基丙酸代谢分向的研究

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 菌株、培养基和培养条件

4．2．2 基因和重组质粒

4．2．3 实验仪器和试剂

4．3 实验方法

4．3．1 RecA重组系统

4．3．2 八个单敲除载体和菌株的构建

4．3．3 单基因敲除与双基因敲除

4．3．4 摇瓶和上罐发酵

4．3．5 SDS-PAGE分析

4．3．6 代谢物分析方法

4．4 结果与讨论

4．4．1 八个单基因敲除菌和K．pneumoniae △adhP△pflB(tac-puuC)的构建

4．4．2 单基因敲除菌的摇瓶发酵分析

4．4．3 K．pneumoniae △adhP△pflB(tac-puuC)的摇瓶发酵分析

4．4．4 K．pneumoniae △adhP△pflB(tac-puuC)的上罐发酵分析

4．4．5 SDS-PAGE分析

4．5 本章小结

第五章 总结与展望

5．1 总结

5．2 创新点

5．3 展望

参考文献

附录

致谢

导师和作者简介

研究成果及发表的学术论文