肺炎克雷伯菌CRP对kfuABC操纵子的转录调控机制研究

摘要

目的:利用分子生物学实验研究肺炎克雷伯菌环磷酸腺苷受体蛋白(cAMP receptor protein,CRP)对kfuABC操纵子的转录调控机制。方法:设计相关跨基因引物,用Real-time PCR方法验证kfuABC的转录结构。以肺炎克雷伯菌野生株NTUHK2044(wild type,WT)的总RNA为模板,利用引物延伸的方法寻找kfuA的转录起始位点,确定其核心启动子区。构建含kfuA启动子区DNA序列的LacZ重组质粒,并将其转入突变株△crp(肺炎克雷伯菌野生株基因组中crp基因敲除)和WT中,通过测定比较两株菌中β-半乳糖苷酶活性差异来判定CRP调控子对kfuA的调控关系;分别提取△crp和WT的总RNA,进一步采用实时定量Real-time PCR的方法验证CRP对kfuA的调控关系。通过凝胶阻滞实验验证His-CRP是否对kfuA启动子区具有直接的结合作用,进一步采用DNaseⅠ足迹实验确定具体的结合位点。结果:肺炎克雷伯菌kfuA、kfuB和kfuC位于同一个操纵子kfuABC;引物延伸实验结果显示kfuABC只有一个转录起始位点T;CRP能够结合到kfuABC启动子区-204到-171之间的碱基序列上(转录起始位点为+1),抑制其转录表达。结论:CRP能直接结合到kfuABC启动子区抑制其转录表达。