耳聋-甲发育不全综合征突变敲入小鼠模型听力研究及歌舞伎脸谱综合征临床表型分析

摘要

本文主要从以下几方面展开论述：　　第一部分 耳聋-甲发育不全综合征突变敲入小鼠模型听力研究　　一、耳聋-甲发育不全综合征突变敲入小鼠模型听觉表型评估　　目的：耳聋-甲发育不全综合征又名DDOD（Dominant deafness-onychodystrophy）综合征，是一类罕见的显性遗传综合征型耳聋。临床表现为感音神经性耳聋、指/趾甲发育不良、锥形牙齿、指骨发育不良、学习记忆障碍等，致病突变为Atp6v1b2 c.1516C>T。为进一步了解DDOD综合征的致病机制，我们前期制作出Atp6v1b2 c.1516C>T突变模型小鼠，并初步解释了模型小鼠学习记忆障碍的分子机制，但耳聋致病机制仍不明确，本部分对模型小鼠进行长期的听觉功能评估，明确听觉功能情况。　　方法：对出生后不同年龄段小鼠进行click ABR和tone burst ABR检测，观察和总结模型小鼠的听力阈值变化情况。此外，对小鼠ABR波I峰值和潜伏期进行分析统计，总结波形变化情况。　　结果：模型小鼠在出生后4周、12周、20周与野生型小鼠相比听力阈值无明显差异，从12周开始ABR波I峰值降低、潜伏期延长。出生后28周和36周模型小鼠相对于野生型小鼠听力阈值升高。　　结论：模型小鼠在出生早期（12周）出现隐匿性听力损失，随着年龄增长（28周），听力阈值逐渐升高，表现出迟发型耳聋。　　二、耳聋-甲发育不全综合征突变敲入小鼠模型耳聋致病机制研究　　目的：Atp6v1b2基因编码V-ATP酶V1部分B亚基，V-ATP酶分布于真核细胞中包括溶酶体在内的囊泡型细胞器表面。前期研究证实Atp6v1b2基因在小鼠内耳广泛表达，其中在毛细胞和螺旋神经节细胞中高表达。早期体外细胞实验证明ATP6V1B2 c.1516C＞T通过单倍剂量不足导致溶酶体pH升高、降解功能异常，并且在小鼠内耳局部敲低Atp6v1b2基因表达，小鼠出现耳聋症状。然而Atp6v1b2 c.1516C＞T是如何通过溶酶体降解功能异常导致听力下降，其致病通路仍需进一步明确。　　方法：1.通过免疫荧光标记小鼠内耳不同类型细胞和细胞器，利用激光共聚焦显微镜观察耳蜗内细胞形态大体变化和相关蛋白分布情况。2.借助透射电镜和扫描电镜观察细胞或细胞器的细微变化。3.利用Western Blot检测蛋白浓度变化情况。　　结果：1.模型小鼠出生后12周、20周耳蜗内神经纤维出现脱髓鞘，随着年龄增长（28周），神经纤维逐渐减少、毛细胞纤毛排列紊乱并有少量缺失。2.模型小鼠耳蜗螺旋神经节细胞内溶酶体降解功能异常且Caspase3被过度激活。　　结论：Atp6v1b2 c.1516C＞T导致的溶酶体降解功能异常可能通过活化Caspase3诱发细胞凋亡引起听力下降。　　三、耳聋-甲发育不全综合征突变敲入小鼠模型听觉功能补偿机制研究　　目的：临床上，DDOD综合征患者听力学表现为先天性重度感音神经性耳聋，然而DDOD模型小鼠早期无听力阈值改变，ABR波I峰值降低、潜伏期延长诊断为隐匿性听力损失。随着年龄增长其听力阈值逐渐下降，推测早期可能存在功能补偿机制。　　方法：利用RNAscope技术检测模型小鼠耳蜗内Atp6v1b2基因和编码V-ATP酶B亚基其他亚型的基因转录水平并进行统计分析。　　结果：纯合突变小鼠耳蜗内毛细胞和螺旋神经节细胞Atp6v1b2基因的转录水平均降低，Atp6v1b1基因的转录水平在毛细胞内升高，在螺旋神经节细胞内无明显升高。　　结论：DDOD综合征小鼠在耳蜗毛细胞内存在功能补偿机制。　　第二部分 歌舞伎脸谱综合征临床表型分析　　目的：1.对表现出特殊面容、发育迟缓、智力低下、椎骨发育异常、肌张力低等疑似歌舞伎脸谱综合征（Kabuki综合征，KS）表型的1例耳聋患者进行分子检测，明确疾病病因；2.通过回顾性系统分析，了解KS主要表型及合并耳聋症状的特点及发生频率。　　方法：1.对先证者及其父母DNA进行全外显子组测序，分析并明确致病突变；2.检索相关数据库，对2010年8月起至2019年3月间首次明确KS分子病因的报道中所描述的KS临床特征进行筛选、归纳和总结。　　结果：1.基因检测显示先证者携带KMT2D基因c.15777insT变异（p.Pro5260fs*10），按ACMG变异解读标准将其分类为PVS1+PS1+PM2，属于致病突变。2.归纳出77篇符合条件的文献，结合本文一例患者，共收集462例KS病人信息，主要表现为特殊容貌（462例）、智力障碍（305例）、先天性心脏缺损（227例）等。其中101例听力下降的KS患者中，出现多种听力下降类型且大部分患者耳聋类型不明。　　结论：1. KMT2D基因c.15777insT变异为首次明确的致病突变。2.歌舞伎脸谱综合征涉及的器官较为广泛，各器官症状严重程度不一，仅仅从表型上判断容易存在误诊和漏诊的风险。3.应加强对KS患者在听力学方面的诊断和关注，并且尽早完善相关基因检测，实现早诊断、早干预。

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