PM2.5抑制A549细胞抗病毒天然免疫的作用及分子机制

摘要

背景：大气细颗粒物(PM2.5)是近年来空气污染与人体健康研究的关注重点之一。PM2.5指空气动力学直径≤2.5μm的颗粒物，可悬浮于大气中并能够通过呼吸道进入人肺深部发挥毒效应。PM2.5被证明可能是多种病原微生物(主要为细菌和病毒)实现人与人之间传播的新的中介物质，且长期暴露于PM2.5可使得人体免疫功能异常。既往研究多对PM2.5的理化组分及其对人体健康的毒效应进行分析，较少关注PM2.5暴露和病毒感染对人体免疫功能的交互效应。因此，本研究主要以PM2.5对水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)诱导激活的抗病毒天然免疫功能的影响及机制作为主要切入点进行研究，为揭示PM2.5暴露对肺部感染RNA病毒患者的影响提供线索。　　方法：(1)体外细胞实验：用携带GFP荧光基因的VSV(MOI=1)感染人肺腺癌A549细胞并暴露于200μg/mLPM2.5中24h，同时设立空白对照组和PM2.5(200μg/mL)单独刺激组。通过CCK-8方法观察A549细胞活力。倒置荧光显微镜用于观察GFP荧光。采用流式细胞仪检测A549细胞摄取PM2.5情况和GFP荧光强度。采用Hoechst33342染色观察细胞凋亡情况。通过实时定量聚合酶链(RT-qPCR)检测水疱性口炎病毒糖蛋白(Vesicular stomatitis virus glycoprotein， VSV-G)、干扰素β(Interferonβ，IFN-β)、干扰素刺激基因因子15(Interferon Stimulated Gene 15，ISG15)、细胞趋化因子5(CCL-5)和趋化因子配体10(C-X-C motif chemokine 10，CXCL-10)的mRNA表达。酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)检测细胞培养基上清中IFN-β蛋白表达。采用Western-Blot实验观察抗病毒途径相关蛋白的表达，如β-肌动蛋白(β-Actin)，人TANK结合激酶1(TBK1)，干扰素调节因子(Interferon regulatory Factor 3， IRF-3 )，磷酸化IRF-3(p-IRF-3 )，磷酸化细胞外调节蛋白激酶(phospho-Extracellular Regulated Kinase1/2，p-ERK1/2)，磷酸c-Jun氨基末端激酶(phospho-c-Jun N-terminal kinase，p-JNK)，磷酸化促分裂素原活化蛋白激酶38(phospho-mitogen-activated protein kinases，p-P38)和VSV-G。采用蛋白酶体抑制剂(MG132)预处理2h，观察PM2.5+VSV处理的A549细胞GFP荧光强度、VSV-G的mRNA和蛋白的表达。采用BGISEQ-500平台进行RNA-seq，观察不同处理组间的差异基因表达，从中选取泛素化相关蛋白合成干扰RNA(siRNA)沉默A549细胞，观察PM2.5+VSV处理的A549细胞中TRIM73mRNA表达和VSV-G蛋白表达情况。　　(2)体内实验：购买40只6-8周龄C57BL/6J小鼠，雌雄各半，采用随机数字表法将40只小鼠随机分为Control组、VSV组、PM2.5组和PM2.5+VSV组四组，每组10只，进行肺部VSV感染和(或)PM2.5暴露模型建立，Control组小鼠全程均采用PBS处理作为空白对照。观察四组小鼠10d内体重变化、进食量和饮水量；观察四组小鼠肺脏、肝脏和脾脏湿重。取小鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)进行涂片并采用Diff-Quick染色剂进行染色，观察BALF中免疫细胞情况；采用ELISA观察BALF中IFN-β蛋白表达；采用RT-qPCR观察肺组织中IFN-β的表达，以验证细胞实验结果。　　结果：随着PM2.5浓度增加，SSC-H值增大的细胞比例增多，GFP荧光增加，VSV-G也增加，且与PM2.5呈现正向剂量依赖性。终浓度为200μg/mL的PM2.5在3h、6h、12h和24h对A549细胞活性抑制作用均强于其他浓度，差异具有统计学意义(P＜0.05)。单独VSV刺激组A549细胞在24h时才出现显著细胞活力抑制，而加入PM2.5后自6h起A549细胞活力就被明显抑制，差异具有统计学意义(P＜0.05)。PM2.5暴露合并VSV感染的A549细胞核染色质凝集、细胞碎裂现象出现，提示细胞凋亡。在β-Actin相一致的情况下，随着PM2.5浓度的升高，VSV感染的A549中Caspase-3和Caspase-9逐渐减少，提示Caspase-3和Caspase-9被切割激活，细胞凋亡启动。与VSV组相比，VSV+PM2.5组IFN-β、ISG15、CCL-5和CXCL-10的mRNA表达均显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。PM2.5能够协同VSV促进ERK和P38磷酸化，抑制VSV诱导p-IRF-3的表达。MG132预处理组A549细胞中p-IRF-3表达高于DMSO处理组，GFP绿色荧光强度明显减弱，且VSV-GmRNA和蛋白表达降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。RNA-seq火山图结果显示PM2.5+VSV组与VSV组相比，上调基因217个，下调基因345个。差异基因KEGGPathway富集气泡图显示，差异基因富集最多且基因数量最多的通路是细胞因子与细胞因子受体相互作用。将TRIM73siRNA转染至A549细胞24h，再加入VSV和PM2.524h，TRIM73siRNA沉默效果较好，且p-IRF-3蛋白表达回升，VSV-G蛋白表达降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。四组小鼠10d总进食量相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)，其中PM2.5+VSV组小鼠进食量最多。BALF的DiffQuick染色结果显示，PM2.5和PM2.5+VSV组的小鼠BALF中巨噬细胞增多。PM2.5+VSV组小鼠肺组织IFN-βmRNA核BALF中IFN-β蛋白表达显著低于VSV组，但仍显著高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与本研究中体外研究结果相一致。　　结论：　　1.PM2.5能够促进VSV增殖并协同发挥细胞毒性诱导A549细胞凋亡。　　2.PM2.5泛素化降解p-IRF-3抑制IFN-β表达从而促进VSV病毒在A549细胞中复制，相应地，PM2.5可抑制IFN-β下游抗病毒相关因子ISG15、CCL-5和CXCL-10的mRNA表达。　　3.TRIM73可能参与PM2.5泛素化降解VSV诱导的p-IRF-3在A549细胞中的表达。　　4.PM2.5暴露合并VSV感染能够增加小鼠10d进食量，且PM2.5同样能够抑制VSV肺部感染所致的小鼠肺组织IFN-βmRNA和BALFIFN-β的表达，与体外结果相一致。

目录

声明

第一章 前 言

1.1大气细颗粒物PM2.5

1.1.1PM2.5简述

1.1.2 大气污染及PM2.5来源

1.1.3PM2.5的污染状况

1.1.4PM2.5与人体健康损害

1.2PM2.5与微生物

1.2.1 PM2.5与病毒

1.3PM2.5与抗病毒天然免疫

1.3.1抗病毒天然免疫概述

1.3.2VSV与抗病毒天然免疫通路

1.3.3泛素化在抗病毒天然免疫中的作用

1.3.4PM2.5细胞毒性与抗病毒天然免疫

2.1体外实验技术路线图

2.2动物实验技术路线图

第三章 实验材料与方法

3.1实验材料

3.1.1城市细颗粒物

3.1.2 实验所用病毒

3.1.3 实验细胞系

3.1.4细胞培养及细胞凋亡流式细胞术材料

3.1.5 空斑试验及q-PCR实验材料

3.1.6 Western-blot实验材料

3.1.7小鼠实验材料

3.2实验仪器

3.3 实验方法

3.3.1 细胞复苏传代和细胞铺板

3.3.2病毒扩增和空斑实验

3.3.3流式细胞术和细胞凋亡检测

3.3.4 CCK-8细胞增殖-毒性实验

3.3.5细胞total RNA抽提和逆转录

3.3.6实时荧光定量PCR（RT-qPCR）

3.3.7 ELISA实验

3.3.8 Western-blot实验

3.3.9 BGISEQ-500 RNA-seq方法

3.3.10TRIM73 siRNA转染方法

3.3.11小鼠分组

3.3.12病毒肺感染和PM2.5肺暴露模型建立

3.3.13小鼠肺泡灌洗液取材及Diff-Quick染色

3.4统计学方法

第四章 实验结果

4.1 PM2.5能够进入A549细胞并促进VSV在A549细胞内增殖

4.2 PM2.5协同VSV抑制A549细胞活力并促进细胞凋亡

4.3 PM2.5抑制VSV在A549细胞中诱导的IFN-β及其相关细胞因子的表达

4.4 PM2.5和VSV对MAPKs通路和RLRs通路关键蛋白的表达影响

4.5PM2.5通过泛素化途径降解p-IRF-3

4.6 RNA-seq原始数据过滤成分统计

4.7RNA-seq差异基因表达分析

4.8TRIM73参与PM2.5泛素化降解p-IRF-3从而促进VSV增殖

4.9不同处理组小鼠肺基础资料分析

4.10小鼠肺PM2.5暴露和VSV感染模型

4.11PM2.5能够抑制VSV诱导的小鼠肺组织表达IFN-β

第五章 讨 论

5.2PM2.5泛素化降解p-IRF-3抑制IFN-β表达从而促进VSV病毒复制

5.3 TRIM73可能参与PM2.5泛素化降解VSV诱导的p-IRF-3在A549细胞中的表达

5.4 VSV肺部感染合并PM2.5暴露小鼠模型建立及体内实验验证

第六章 结 论

参考文献

中英文缩略词表

硕士期间论文发表情况

致谢