丝苏氨酸蛋白激酶Riok3在抗病毒天然免疫中的调控作用及其分子机制

摘要

病毒感染与宿主免疫系统之间的互相作用及其机制探索一直是病毒学和免疫学领域的研究热点。天然免疫作为宿主抵御外来病原体入侵的第一道防线，在识别、清除病原体或将其呈递给T细胞引发细胞免疫，从而维持宿主内稳态的过程中发挥极为重要的作用。当病毒等病原体入侵宿主细胞，其病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)首先被宿主模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)，如维甲酸诱导的基因Ⅰ样受体(retinoid cid-inducible geneⅠ-like receptors，RLRs)和Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）等所识别，从而启动宿主免疫应答。RLRs主要包括视黄酸诱导基因蛋白Ⅰ(retinoic acid-inducible geneⅠ，RIG-Ⅰ)和黑色素瘤分化相关抗原5(melanoma differentiation-associated gene5，MDA5)，研究表明，它们识别水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)、H1N1型流感病毒PR8(Puerto-Rico/8)等RNA病毒后，招募接头分子线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondria antiviral signaling protein，MAVS)，MAVS分别招募TRAF3(tumor necrosis factor receptor-assoeiated factor3)和TRAF6(tumor necrosis factor receptor-associated factor6)，从而激活TRAF3-TBK1-IRF3信号通路和TRAF6-TAK1-NF-κB/MAPK信号通路，激活的转录因子如IRF3与NF-κB入核启动Ⅰ型干扰素和炎性因子等效应分子的释放。Ⅰ型干扰素进一步激活下游JAK/STAT信号通路，产生数百个抗病毒蛋白(interferon stimulated genes，ISGs)，进而抑制病毒、细菌在宿主内的复制。Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是另一类重要的模式识别受体，目前已鉴定出13种TLRs，其中TLR1和TLR9为人鼠共有，TLR10为人类特有，而TLR11和TLR13为小鼠特有。它们特异性识别相关PAMP，激活下游MyD88或TRIF依赖的信号通路，激活IRF3、NF-κB或AP1等转录因子，最终启动产生炎性因子和Ⅰ型干扰素。RLRs和TLRs联结天然免疫应答和获得性免疫应答，其信号活化过度或不足均可能导致由机体免疫功能异常而引发的相关疾病。此外，细胞内还存在识别DNA的PRRs，目前已知的主要包括TLR9、DNA依赖的干扰素调节因子激活物(DNA-dependentactivator of IFN-regulatory factor，DAI)、干扰素刺激基因(stimulatorofinterferon gene，STING)、RNA聚合酶Ⅲ(RNA polymeraseⅢ，PolⅢ)、富亮氨酸重复序列相互作用蛋白1(Leucine-rich repeat flightless-interactingprotein1，LRRFIP1)、AIM2样蛋白(absent in melanoma2)等10余种DNA受体，这些PRRs无差别识别外源或胞内DNA分子，从而介导下游Ⅰ型干扰素和炎症因子的产生，如近年发现的cGAS-STING-TBK1信号通路，cGAS识别并结合DNA分子形成cGAS-DNA复合物，cGAS随后结合并催化ATP、GTP生成cGAMP，生成的cGAMP结合并活化STING分子，使其能通过C端结构域结合并磷酸化TBK1，STING-TBK1复合体结合并激活IRF3，从而启动抗病毒免疫应答。 蛋白激酶是一类主要参与宿主细胞内蛋白磷酸化修饰的酶，通过调节信号通路转导而参与几乎所有细胞生命活动诸如细胞生长、分化、发育、代谢、细胞间相互作用等，从而维持细胞内稳态的平衡。Riok3(RIO Kinase3)为一广泛表达于真核生物的非典型激酶，其结构上缺乏典型的激酶结构域，但保有激酶活性。Riok3含有一个RIO结构域，但其结构与其他RIO家族成员差别较大，目前对其功能研究非常有限。Riok3在免疫细胞中呈高表达，提示了其在宿主免疫应答中的可能作用。之前的研究报道了Riok3在HEK293T细胞中具有调节Ⅰ型干扰素信号通路的功能，但其具体的调控方式及机制并不明确。迄今为止，尚未见Riok3在免疫细胞中的功能研究。 本课题旨在探索Riok3在免疫细胞（原代巨噬细胞）中对Ⅰ型干扰素和相关炎症因子的调控作用及机制。我们首先构建了髓系细胞系特异性敲除Riok3小鼠LysMcreRiok3F/F，采用VSV(Vesicular Stomatitis Virus)、PR8(A/PR/8,H1N1)、SeV(Sendai Virus)、HSV(Herpes Simplex Virus)和MHV68(Murine Gammaherpesvirus68)等多种病毒体外感染Riok3敲除巨噬细胞及体内感染LysMcreRiok3F/F小鼠，发现Riok3选择性负向调控由RNA病毒激活的Ⅰ型干扰素通路，Riok3的缺失抑制RNA病毒在原代巨噬细胞和小鼠体内的复制。接着，我们采用Poly(I∶C)体外转染直接激活RIG-Ⅰ/MDA5受体，发现Riok3亦负向调控由此引起的Ⅰ型干扰素信号通路。上述现象在小鼠成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblasts，MEFs)和HEK293T亦得到证实。同时，我们采用Poly(I∶C)和LPS直接刺激原代巨噬细胞检测Riok3对TLR3/TLR4信号通路的调控作用，发现Riok3正向调控由此引起的Ⅰ型干扰素和炎症因子释放。Western blot检测信号通路磷酸化情况显示，激活RIG-Ⅰ/MDA5时，Riok3缺失的细胞中TBK1、IRF3和NF-κB的磷酸化较对照组增加;而激活TLR3/TLR4时，Riok3缺失的细胞中NF-κB的磷酸化较对照组明显下降。初步机制研究表明，Riok3可与TRAF3分子结合并可能通过影响其不同位点的泛素化进而实现对下游信号通路的不同调控结果。如当RIG-Ⅰ/MDA5被激活时，Riok3可促进TRAF3分子K48泛素化而降解TRAF3分子，进而抑制下游信号通路的转导。 我们的研究首次探索了Riok3在巨噬细胞天然免疫应答中的功能，揭示了以下几点新发现:1）Riok3的缺失选择性抑制RNA病毒在小鼠体内外的复制;2）Riok3负向调控RIG-Ⅰ/MDA5模式识别受体激活触发的免疫应答;3）Riok3正向调控TLR3/TLR4激活诱导的免疫应答;4）Riok3对DNA分子模式识别受体激活触发的免疫应答没有影响;5）Riok3可以通过与TRAF3分子结合，催化其48位赖氨酸残基泛素化，降解TRAF3分子，进而抑制其下游信号通路。我们目前的实验结果初步揭示了Riok3负向调控RIG-Ⅰ/MDA5通路的可能机制，提示Riok3可能作为负调控因子抑制RIG-Ⅰ/MDA5信号通路的过度激活。因此，确认Riok3在由RIG-Ⅰ或MDA5过度激活导致的Ⅰ型干扰素和炎症因子通路、甚至是由此引起的自身免疫性疾病中的负调控作用，具有重要意义。但是，我们尚不清楚Riok3如何正向调控TLR3/4信号通路，下一步我们也将聚焦于其机制研究。我们的研究为深入理解宿主抗病毒天然免疫反应提供了新的思路，为病毒感染过度激活RIG/MDA5信号通路引发的自身免疫病的防治提供了可能的新靶点。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

1引言

1．1 PRRs的功能研究进展简介

1．1．1 RLRs结构、组成及功能介绍

1．1．2 TLRs结构、组成及功能介绍

1．1．3 DNA模式识别受体结构、组成及功能介绍

1．2 TRAF3泛素化研究进展简介

2实验材料与方法

2．1实验材料

2．1．1实验动物

2．1．2实验细胞

2．1．3实验病毒、细菌

2．1．4实验仪器、试剂与耗材

2．2．1主要溶液的配置

2．2．2细胞复苏、传代与冻存

2．2．3细胞总RNA的提取及荧光定量PCR

2．2．4细胞总DNA的提取及MHV68 genome copy number测定

2．2．5细胞蛋白提取、浓度测定及Western blot

2．2．6细胞因子ELISA测定

2．2．7质粒扩增及抽提

2．2．8原代巨噬细胞和MEF细胞提取与培养

2．2．9髓系细胞系特异性Riok3敲除小鼠基因鉴定

2．2．10病毒扩增、滴度测定及体内感染

2．2．11金黄色葡萄球菌生长曲线与CFU测定

2．2．12细胞转染与干扰

2．2．13免疫共沉淀

2．2．14体外泛素化实验

2．2．15激光共聚焦(Confocal)实验

2．2．16 RAW264．7稳转细胞系的构建

2．2．17统计学处理

3实验结果

3．1髓系细胞系Riok3条件性敲除小鼠的构建

3．2 Riok3在体内外负向调控抗病毒天然免疫应答

3．2．1 Riok3的缺失选择性抑制RNA病毒体外复制

3．2．2 Riok3的缺失抑制RNA病毒体内复制

3．2．3 Riok3的缺失促进RNA病毒感染激活的Ⅰ型干扰素信号通路

3．3 Riok3负向调控RIG-Ⅰ／MDA5激活诱导的抗病毒信号通路

3．4 Riok3正向调控TLR3／TLR4激活诱导的抗病毒信号通路

3．5 Riok3不影响DNA胞质受体激活诱导的抗病毒信号通路

3．6 Riok3结合并催化TRAF3泛素化降解

4讨论

5小结

参考文献

综述 蛋白激酶Riok3基因的功能研究进展

作者简介及攻读学位期间科研成果