矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对紫外线导致的雌性小鼠皮肤慢性光损伤的保护作用

摘要

由于臭氧层的破坏，紫外线(Ultraviolet，UV)到达地面的强度越来越大。人体皮肤过度暴露于紫外线下会导致皮肤光损伤，包括急性损伤和慢性损伤。其中，慢性光损伤对人类皮肤所造成的伤害是持续性的、短时间内不易察觉的、甚至有可能是不可逆的，它与我们的健康息息相关。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyanidin-3-O-glucoside，C3G)是一种广泛存在于果蔬中的黄酮类化合物，具有很强的抗氧化及抗炎等生物活性，是防护UV诱导的皮肤慢性光损伤的潜在物质。本课题主要采用UVA+UVB混合UV模拟日光照射雌性小鼠，分别通过喂食以及涂抹C3G进行干预，探讨C3G对皮肤慢性光损伤的保护作用及其机制。　　通过对4-6周龄的雌性小鼠进行每两天一次的UVA+UVB混合UV辐照，对小鼠背部皮肤造成慢性光损伤，同时给予小鼠膳食摄入C3G(1000 mg/kg)或在小鼠背部皮肤涂抹浓度为5mg/mL的C3G乳霜，实验持续13周。实验结束后，对小鼠进行拍照，并且获取血清、皮肤组织，测定相关指标。(1)观察小鼠皮肤的外观变化，测定表征皮肤屏障功能的相关指标，通过苏木素-伊红染色观察小鼠皮肤组织的病理变化。(2)通过酶联免疫吸附试验和试剂盒测定皮肤中相关抗氧化酶含量及脂质过氧化产物含量，评价C3G对皮肤抗氧化系统的保护作用；利用免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)对皮肤的DNA氧化损伤标志物进行测定、采用TUNEL荧光进行凋亡测定、采用蛋白免疫印迹对皮肤细胞凋亡相关蛋白表达进行分析，探究C3G对氧化损伤介导的DNA损伤的保护作用。(3)通过采用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR，qPCR)、IHC、免疫荧光(Immunofluorescence，IF)分析小鼠皮肤中炎症相关基因的表达及炎症细胞浸润情况，探索C3G对UV导致的炎症的保护作用。(4)采用Masson染色观察皮肤真皮层胶原纤维的情况，采用羟脯氨酸试剂盒测定胶原蛋白的含量，并通过IHC和qPCR来测定胶原蛋白合成和降解相关基因的表达，探讨C3G对UV破坏胶原蛋白的稳态的改善作用机制。　　结果表明，UV辐照之后，小鼠皮肤出现了粗糙变硬、失去光泽、表皮增生、太阳疤痕等现象，同时，UV也增加了经皮水分流失，而膳食摄入或涂抹C3G后，小鼠的皮肤外观得到了改善，皮肤屏障功能也得到了一定的修复。膳食摄入C3G或涂抹C3G都能通过改善皮肤的抗氧化系统来减少UV诱导的脂质过氧化产物以及DNA的氧化性损伤。此外，膳食摄入或涂抹C3G均可显著性降低UV诱导的炎症相关基因的表达以及炎症细胞的浸润。小鼠背部皮肤暴露于UV辐照之后，皮肤的胶原纤维会出现排列紊乱及异常沉积的现象，膳食摄入或涂抹C3G均可以通过调节胶原蛋白的合成和降解来改善胶原纤维异常沉积现象。本研究成果表明膳食摄入或涂抹C3G均可以发挥保护皮肤慢性光损伤的作用，为研究花色苷保护皮肤慢性光损伤提供理论依据。

目录

声明

第一章 前言

1.1 紫外线导致的皮肤光损伤概述

1.1.1 紫外线与皮肤光损伤

1.1.2 紫外线导致皮肤光损伤的机制

1.2 花色苷概述

1.2.1 花色苷的生物活性

1.2.2 花色苷抗皮肤光损伤的研究现状

1.3 论文思路及技术路线图

1.4 本研究的创新性

第二章 材料方法

2.1 实验材料、试剂及仪器

2.1.1 实验动物

2.1.2 实验仪器

2.1.3 实验抗体信息

2.1.4 PCR引物信息

2.1.5 其他实验试剂及试剂盒

2.1.6 主要试剂配制

2.1.7 动物饲料的制备

2.1.8 乳霜的制备

2.2 实验方法

2.2.1 动物分组处理及样本采集

2.2.2 苏木素-伊红染色

2.2.3 Masson染色

2.2.4 EVG弹力纤维染色

2.2.5 免疫组化

2.2.6 免疫荧光

2.2.7 TUNEL凋亡测定

2.2.8 蛋白提取及免疫印迹

2.2.9 RNA提取及qRT-PCR

2.2.10 HYP含量测定

2.2.11 组织氧化应激水平测定

2.2.12 数据处理及统计分析

第三章 结果与分析

3.1 C3G对皮肤慢性光损伤的保护作用

3.1.1 实验结果

3.1.2 讨论

3.1.3 小结

3.2 C3G对UV导致的氧化应激的影响

3.2.1 实验结果

3.2.2 讨论

3.2.3 小结

3.3 C3G对UV导致的炎症的保护作用

3.3.1 实验结果

3.3.2 讨论

3.3.3 小结

3.4 C3G可以改善UV诱导的胶原纤维的异常沉积

3.4.1 实验结果

3.4.2 讨论

3.4.3 小结

第四章 结论与展望

4.1 全文总结

4.2 前景与展望

参考文献

英文缩略词汇总表

攻读硕士学位期间的科研情况

致谢