慢病毒法建立OVA-Luc-GFP-H22细胞株及小鼠原位肝癌模型的构建

摘要

目的：（1）构建重组慢病毒载体OVA-Luc-GFP-pLVA7，包装出慢病毒后感染H22细胞，建立能稳定表达OVA、GFP及Luc蛋白的H22细胞株。（2）用此细胞系构建小鼠原位肝癌模型，利用小动物成像仪检测Luc（荧光素酶）及GFP（绿色荧光蛋白）表达，探索此模型的应用。
　　方法：（1）构建重组慢病毒载体 OVA-Luc-GFP- pLVA7，设计引物应用 PCR技术得到OVA-Luc融合基因，经EcoRI-HF和HindIII-HF双酶切并纯化PCR产物，同时提取慢病毒载体pLVA7（带有GFP标签），经EcoRI-HF和HindIII-HF双酶切；通过DNA assembly mix连接酶，将OVA-Luc融合基因装载到慢病毒载体pLVA7中并测序验证。提取慢病毒辅助质粒pMD2.G、包膜蛋白质粒psPAX2,三质粒系统用PEI(聚乙烯亚胺)转染293T细胞制备病毒，感染H22细胞。显微注射仪挑选稳定表达OVA-Luc-GFP- H22单克隆，扩增成细胞系。（2）将此细胞系注射到小鼠肝脏构建原位肝癌动物模型，通过小动物成像仪检测 GFP基因表达及Luc荧光素酶基因的表达。
　　结果：（1）构建的OVA-Luc-GFP-pLVA7重组慢病毒载体经酶切电泳和测序结果与预期基因序列一致。经293T细胞包装慢病毒上清，感染H22细胞系通过荧光显微镜能检测GFP表达，利用生物发光成像可检测Luc表达；成功用显微注射仪分选出稳定表达OVA-Luc-GFP-H22单克隆，并扩增细胞系。（2）以OVA-Luc-GFP-H22细胞系成功建立小鼠原位肝癌模型，利用小动物成像仪可检测Luc荧光素酶的表达，但未检测到GFP绿色荧光蛋白表达。
　　结论：（1）构建重组慢病毒载体OVA-Luc-GFP-pLVA7，包装出表达OVA-Luc-GFP基因病毒，并感染H22细胞，建立稳定表达OVA-Luc-GFP-H22细胞系，并在体外表达。（2）成功利用 OVA-Luc-GFP-H22细胞系建立小鼠原位肝癌模型，实现小鼠肝癌细胞的体外活体监测。

目录

声明

前言

材料与方法

1.实验材料

2.实验方法

3.统计学处理

结果

1.基因OVA-Luc的PCR扩增结果

2.pLVA7慢病毒载体双酶切结果

3.pLVA7慢病毒载体酶切产物与OVA-Luc的PCR产物连接及转化结果

4. OVA-Luc-GFP-pLVA7重组质粒酶切鉴定结果

5. OVA-Luc-GFP-pLVA7重组质粒序列分析

6. 利用293T细胞包装慢病毒的免疫荧光结果

7.用表达OVA-Luc-GFP产物的慢病毒感染H22细胞

8. 利用显微操作仪挑选稳定表达OVA-Luc-GFP单克隆细胞

9.小动物成像仪检测OVA-Luc-GFP-H22细胞系Luc荧光素酶的表达

10．小动物成像仪检测OVA-Luc-GFP-H22细胞GFP的表达

11. Western-Blot检测OVA蛋白的表达

12.细胞生长观察

13. OVA-Luc-GFP-H22细胞小鼠肝脏原位注射通过小动物成像仪检测荧光素酶结果

14. 肉眼观察肝脏移植肿瘤块大体形态及大小

15. 肿瘤结节病理切片及HE染色

讨论

结论

参考文献

致谢

附录 A主要英文缩略词表

附录 B常用试剂配制

附录C个人简历：

附录D综述：小鼠肝癌模型的研究进展