低pH孵放法灭活生物制品中慢嗜性小鼠白血病病毒的方法学研究

摘要

生物制品包括血液制品、基因制品、病毒类疫苗等，为了提高生物制品临床使用的安全性，生产工艺要具有一定的去除或灭活部分病毒的能力，生产过程中应有特定的去除或灭活病毒的方法。重组融合蛋白属于基因制品的一种，目前上市销售的重组融合蛋白类生物制品包括TNF-α、IFN-γ、IL-18、IL-12等，此类蛋白主要以中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary，CHO）作为表达载体。目前，CHO细胞表达抗体药物已经产业化。然而，CHO细胞内本身存在内源性逆转录病毒，这一结论已经得到证实;但这种内源性逆转录病毒对人类不具有致病性。尽管这种内源性逆转录病毒对于人类是非致病性的，但采用CHO细胞作为药用蛋白质的表达载体，其分泌的蛋白质对于人用药的安全性仍然具有的一定潜在风险。因此，各国新药研发相关法规要求对于CHO细胞来源的药用蛋白质，其生产工艺中必须具备病毒去除或灭活工艺，而且，必须对该工艺在实验室进行病毒去除或灭活的验证检验。我国相关生物制品生产厂家及生产品种逐年增多，但实验室验证研究的方法国内目前尚未建立，需在美国进行试验，因而时间长、费用高成为制约国内相关新药研发的关键问题。本课题根据SFDA相关法规和技术要求，建立此类蛋白药物的病毒灭活验证方法，以填补国内空白。
　　 此外，本课题中建立的异嗜性小鼠白血病病毒(X-MulV)致猫神经星形胶质细胞（PG-4）产生病变效应的体外模型，不仅可以用于生物制品中病毒灭活验证检验，亦可用于抗逆转录病毒新药的筛选及药效学评价。
　　 美国FDA及我国SFDA要求:对于CHO细胞来源的重组蛋白在低pH生产工艺的验证性试验中，采用X-MulV作为CHO细胞内源性逆转录病毒的指示病毒（又称作模拟病毒、替代病毒），建立低pH孵放法病毒灭活验证方法。
　　 本课题共分三个部分进行研究:
　　 一、X-MulV体外培养及活性评价体系的建立
　　 目前国外研究者采用Mus.Dunni细胞对X-MulV进行传代，由于该细胞株在国内即为少见，同时考虑到X-MulV能够在非小鼠细胞系生长的特点，我们选择以CHO细胞作为X-MulV的传代细胞，通过SYBR Green荧光定量聚合酶连反应(SYBR Green real-time PCR assay)，以gag基因作为靶基因，定量X-MulV在CHO细胞中生长2～7天的相对表达量，并通过病毒感染性试验(PG-4细胞空斑试验)确定病毒数量显著增加时间点的病毒滴度。
　　 结果显示:分别以培养时间作为横坐标、以指示病毒gag基因RNA的相对表达量作为纵坐标，绘制gag基因RNA相对表达量随时间变化的曲线。曲线显示:gag基因在CHO细胞中生长2～7天的生长曲线符合指数形式，指数方程拟合相关系数R2=0.9125，生长第7天的数量比第2天显著增长(p＜0.01)，是第2天的13.89倍。
　　 经CHO细胞传代培养7天的X-MulV悬液，其在指示细胞PG-4上的病毒滴度为8.78±0.25 log10PFU/mL。病毒灭活方法指导原则中规定:作为指示病毒的病毒，其病毒滴度必须达到7.0 log10以上。
　　 因此，以CHO细胞作为X-MulV的传代细胞，经培养7天得到的病毒悬液能够用于病毒灭活验证试验。
　　 二、低pH法灭活生物制品中X-MulV方法的建立
　　 1.缓冲体系的建立:在灭活验证试验中，模拟重组蛋白质的生产工艺，以Tris-碱-柠檬酸缓冲液体系作为样本缓冲液，将样本缓冲液与X-MulV储备液以9∶1体积比混匀后，进行病毒灭活验证试验。
　　 2.检测指标:以病毒滴度作为检测指标，当降低的病毒滴度大于4.0 log10PFU视为有效灭活。
　　 3.灭活参数考察:包括pH值、灭活温度、灭活时间以及蛋白质浓度对灭活效果的影响。灭活试验中设置不同因素、不同水平参数如下:灭活pH值:3.00、3.50、4.00以及5.00;灭活温度:4℃、10℃、20℃以及25℃;灭活时间:2h、4h、6h、8h以及10h;蛋白质浓度（以卵清白蛋白作为模拟蛋白，OVA）:0 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL、5.0 mg/mL、6.0 mg/mL、7.0 mg/mL、8.0 mg/mL、9.0 mg/mL以及10.0 mg/mL。将不同因素、不同水平按照排列组合的方式组合后，分别进行病毒灭活验证试验。
　　 对所有得到的残余病毒滴度进行统计学分析，通过正交分析主成分分析得出:不同因素对病毒滴度的影响大小依次是:pH＞温度＞时间;pH值和温度对病毒滴度有显著的影响(p＜0.01)，时间不具有显著性影响(p=0.264);通过正交分析交互作用分析得出:温度和时间之间的交互作用对病毒滴度具有显著性影响(p=0.016);通过正交分析筛选出的最优灭活条件为:pH3.50、4℃、4h。多元线性回归分析显示:pH值能够显著影响病毒滴度(p＜0.01)，温度能够影响病毒滴度，但影响不具有显著性(p=0.081)，时间对病毒滴度没有影响(p=0.941)。结合上述分析结果，同时考虑到实际灭活工艺在常温条件下进行;因此，在考察蛋白质浓度对病毒滴度的影响时，在pH3.50、4h一致的前提下，同时考察4℃和25℃的灭活效度。经灭活后，蛋白质浓度从0 mg/mL～10.0 mg/mL范围内，4℃组和25℃组病毒滴度降低分别大于4.1 log10PFU和4.7 log10PFU;且25℃组样本病毒降低滴度基本大于5.0 log10PFU。
　　 在此基础上，进行pH值、温度及时间因素允许范围的考察。通过病毒感染性试验，当灭活温度为25℃、孵育4h时，pH值在3.60～3.90范围内，X-MulV病毒滴度降低均大于5.0 log10PFU;当pH为3.60、孵育4h时，温度在23℃、24℃、25℃、26℃以及27℃范围时，X-MulV病毒滴度降低均大于5.0 log10PFU;当pH值为3.60、孵育温度为25℃时，灭活0～180 min不能有效灭活X-MulV，灭活240 min能够有效灭活X-MulV。通过参数允许变化范围的考察，结合相关文献报道:pH3.50时，生物制品会有少量损失。我们将最优灭活条件设为:pH3.60、25℃及4h。
　　 4.逆转录酶活性检测:为了进一步评价灭活效度，采用产物增强的逆转录酶反应法（简称为PERT法）考察X-MulV灭活前后逆转录酶活性的变化。结果显示:以MMLV作为已知浓度的标准逆转录酶，通过逆转录酶浓度-CT值标准曲线，计算样本中逆转录酶的含量。经SYBR Green荧光定量PCR反应检测逆转录酶活性，经pH3.50、4h灭活后，逆转录酶含量比未灭活样本降低两个数量级，具有显著性差异(p＜0.01)，且4℃组与25℃组之间没有显著性差异(p＞0.05)。
　　 5.低pH对生物制品活性的影响:选择L929细胞株作为靶细胞，采用MTT比色法检测rhTNF-α的对L929细胞的杀伤活性。将rhTNF-α经pH3.60、25℃孵育4h后，其杀伤L929细胞活性与中性rhTNF-α相比，未发生变化。
　　 6.低pH对病毒包膜基因的影响:利用传统聚合酶链式反应，考察X-MulV在有效灭活前后，包膜基因env3'末端1626～1930位点片段的扩增情况。X-MulV经pH3.60、25℃灭活4h后，env3'末端305 bp片段未扩增出，而阳性对照中该片段条带清晰，且亮度高。
　　 三、试验方法的实际应用
　　 采用pH3.60、25℃、4h的灭活条件对百奥泰（广州）生物科技有限公司提供的注射用rhTNF-α融合蛋白进行X-MulV的灭活验证，结果显示病毒滴度降低4.0 log10以上，说明此条件能够有效灭活指示病毒X-MulV，符合国际规定的病毒滴度降低大于4.0 log10的要求。
　　 通过以上研究，我们得出结论:
　　 1.以CHO细胞作为X-MulV的传代载体，培养7天，获得的X-MulV病毒悬液，在PG-4细胞中的病毒滴度能够达到7.0 log10PFU以上，符合生物制品病毒灭活指导原则关于指示病毒的要求;
　　 2.采用pH3.60、25℃、4h灭活CHO细胞来源的人重组融合TNF-α蛋白药物中指示病毒X-MulV，能够实现有效灭活，其病毒滴度降低大于4.0log10PFU，说明通过本研究建立的验证性试验方法可行;
　　 3.此灭活条件对所检测样品的生物学活性无影响;
　　 4.低pH影响包膜基因env3'末端1626～1930位点，X-MulV能够被有效灭活可能与该位点有关。

目录

声明

摘要

英文缩略语

综述一 生物制品安全性概述

综述二 生物制品安全评价相关法规概述

综述三 生物制品中病毒灭活方法研究概况

综述四 逆转录病毒及逆转录酶检测方法研究概况

前言

第一部分 X-MulV体外培养及活性评价体系的建立

第二部分 低pH法灭活生物制品中X-MulV方法的建立

1 最佳pH值、温度及时间的筛选

2 蛋白质浓度对X-MulV灭活效果影响的研究

3 低pH法灭活人重组融合蛋白TNF-α中X-MulV

4 pH值、温度、时间允许范围考察

4．1 pH 3．60～3．90范围的考察

4．2 (25±2)℃温度范围的考察

4．3 (0～240)min时间范围的考察

4．4 小结

5 最佳灭活条件对X-MulV逆转录酶活性的影响

6 低pH对重组人TNF-α融合蛋白生物学活性的影响

7 最佳灭活条件对X-MulV包膜基因env表达的影响

第三部分 人重组TNF-α融合蛋白中X-MulV灭活验证检验

讨论

结论

参考文献

致谢

个人简历

附录

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