口虾蛄金属硫蛋白的提取与纯化制备工艺研究

摘要

金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一类普遍存在于生物体且富含半胱氨酸(Cys)的一类低分子量蛋白，已在包括原核生物、植物、无脊椎动物和脊椎动物等多种生物中分离并被研究应用。通过其半胱氨酸硫醇基团与重金属具有结合能力，在金属稳态和重金属毒性、DNA损伤、氧化应激、拮抗电离辐射等保护中起重要作用，并为其他金属蛋白和金属酶类提供活性中心，在营养保健、医药、生物工程、养殖及环境监测保护方面有着广泛的应用。　　本研究以口虾蛄（Oratosquilla oratoria）为原料，进行MT的提取与纯化制备工艺研究，一方面为海洋生物资源的开发和利用提供新的思路，另一方面也为后续开展口虾蛄体内重金属元素富集机理研究打下基础。研究内容如下:　　1.为高效利用口虾蛄制备MT，以口虾蛄MT提取量为指标，考察液料比、Tris-HCl提取液浓度、提取温度、提取液pH、提取时间等因素对MT提取效果的影响。采用单因素试验结合响应面分析法优化试验条件，得到了口虾蛄MT的最佳提取工艺:液料比为4，Tris-HC1提取液浓度为0.02mol/L，提取温度为51℃，提取液pH为7.8，提取时间l h;此条件下口虾蛄MT最大提取量为0.232mg/g，该结果与理论预测值基本相符。　　2.利用Sephadex G-50凝胶柱和DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱对粗蛋白进行分离纯化，获得了口虾蛄MT的分离与纯化制备条件。Sephadex G-50洗脱条件为:0.02mol/L Tris-HCl(pH8.0)洗脱、流速0.8mL/min、8mL/管，洗脱体积450mL;DEAE Sepharose Fast Flow洗脱条件为:先用0.02mol/L Tris-HCl(pH8.6)结合0.02mol/L Tris-HCl+0.5mol/L NaCl(pH8.6)溶液进行洗脱、0.8mL/min、8mL/管，洗脱体积500mL。220nm下紫外比色同时结合ICP-MS测定金属元素信号进行对比确认。分离物再经Sephadex G-25脱盐得到高纯度的口虾蛄MT-1、MT-2。MT-1经高效液相凝胶过滤色谱法和Tricine-SDS-PAGE电泳测定，其分子量约为15KDa。由高效液相色谱-荧光检测法和高效液相分子排阻色谱-紫外检测法测定，根据面积归一法计算目标物出峰面积，得到口虾蛄MT-1的纯度大约在91.50％。　　3.对分离纯化的高纯度口虾蛄MT物进行Cu、Zn等金属元素结合量、等电点、氨基酸组成和纯度测定，再使用紫外光谱法、红外光谱法、圆二色谱法等对纯化产物进行结构表征。结果显示:口虾蛄MT-1主要是以Zn-MT的形式存在，另外还结合了较多的Cu;MT-1的等电点(pI)为4.1;口虾蛄MT中半胱氨酸(Cys)占总氨基酸的32.44％，不含芳香族氨基酸;经紫外光谱分析，口虾蛄MT-1溶液在270nm左右处有明显的吸收峰，在280nm处没有吸收峰，加入EDTA处理后270nm处吸收峰消失;红外光谱分析表明口虾蛄MT的吸收带均对应着Ⅰ型无规则卷曲构型，其中MT-1与MT-2的酰胺带Ⅰ位分别位于1640.92cm-1处和1642.03cm-1处，主要由酰胺C=O强伸缩振动引起、并伴有NH弯曲振动（剪式）;而酰胺带Ⅱ依次位于1537.32cm-1处和1539.50cm-1处，由NH弯曲振动与C-N中度伸缩振动引起，酰胺带Ⅲ均不太明显，但伴有C-N中度伸缩振动峰;圆二色谱(CD)分析显示口虾蛄MT-1、MT-2的二级结构主要为无规则卷曲构像，伴有一定的β-折叠，且口虾蛄MT-1、MT-2的二级结构较为接近，这与红外光谱分析结果一致。抗氧化活性初步评价试验显示:DPPH自由基的清除能力大小顺序依次为兔肝MT-1＞兔肝MT-2＞口虾蛄MT-1＞口虾蛄MT-2＞VC。综上，本研究不仅为金属硫蛋白的制备提供了新的技术路线，也为揭示口虾蛄重金属富集机理提供了基础。

目录

声明

摘要

第一章绪论

1．1 MT的结构分类

1．1．1 MT的结构

1．1．2 MT的分类

1．2 MT的提取与离纯化研究现状

1．2．1 MT的提取

1．2．2 MT的分离纯化

1．3 MT的检测技术

1．4 MT的生理功能

1．4．1重金属解毒作用

1．4．2清除自由基和抗氧化作用

1．4．3抗肿瘤作用

1．4．4防辐射作用

1．5 MT的开发及应用研究进展

1．5．1环境监测中的应用

1．5．2医药及生物工程方面应用

1．5．3营养保健中的应用

1．5．4养殖业中的应用

1．6选题依据及研究路线

1．6．1选题依据

1．6．2研究内容及技术路线

第二章口虾蛄金属硫蛋白的提取工艺研究

2．1实验材料

2．1．2主要试剂

2．1．3仪器与设备

2．2实验方法

2．2．1口虾蛄体内金属元素含量测定

2．2．2口虾蛄MT的提取

2．2．3 MT粗品制备

2．2．4单因素试验

2．2．5响应面试验

2．2．6 MT含量测定

2．2．7数据统计与分析

2．3结果与分析

2．3．1口虾蛄中金属元素含量

2．3．2 DTNB法测定MT结果分析

2．3．3高效液相-荧光检测MT结果分析

2．3．3单因素实验结果

2．3．4响应面法优化分析

2．4本章小结

第三章口虾蛄金属硫蛋白的分离纯化

3．1实验材料

3．1．1主要试剂

3．1．2仪器与设备

3．2实验方法

3．2．1工艺流程

3．2．2 MT分离纯化

3．2．3纯度鉴定

3．3结果与讨论

3．3．1 ENrichTM SEC 70精装柱分子筛结果分析

3．3．2 Sephadex G-50凝胶过滤层析结果分析

3．3．3 DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析结果分析

3．3．4 SephadexG-25脱盐结果分析

3．3．5纯度鉴定结果分析

3．4本章小结

第四章口虾蛄金属硫蛋白的结构表征

4．1．1主要试剂

4．1．2仪器与设备

4．2实验方法

4．2．1金属结合量分析

4．2．2分子量测定分析

4．2．3氨基酸的组成分析

4．2．4等电点分析

4．2．5紫外光谱分析

4．2．6红外光谱分析

4．2．7圆二色谱分析

4．2．8抗氧化活性评价(DPPH清除率)

4．3结果分析

4．3．1金属元素结合量分析

4．3．2相对分子质量测定结果

4．3．3氨基酸分析

4．3．4等电点分析

4．3．5紫外光谱分析

4．3．6红外光谱分析

4．3．7圆二色谱分析

4．3．8口虾蛄MT对DPPH自由基清除作用

4．4本章小结

总结与展望

论文结论

展望

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文及研究成果