东海乌参(Acaudina Ieucoprocta)多糖的结构鉴定及活性研究

摘要

东海乌参（学名:白肛海地瓜Acaudina leucoprocta），属于芋参目(Molpiadida)尻参科(Caudinidae)，盛产于中国浙江沿海海域。本文以东海乌参为研究对象，从其体壁中提取分离多糖成分，采用化学和波谱学的方法对其结构进行系统分析，并对其活性进行评价，研究结果如下:　　东海乌参经1％KOH60℃提取3h后，调节pH至6.7，使用4％木瓜蛋白酶56℃酶解2.5h最终粗多糖得率为4％。经Q Sepharose Fast Flow(QFF)阴离子交换柱层析以及Sephacryl S-200凝胶渗透柱层析纯化后得到两个多糖组分:WS-1和WS-2。理化性质分析表明WS-1组分总糖含量为59％，蛋白含量为8％，硫酸基含量为15％;WS-2组分总糖含量为54％，蛋白含量为4％，硫酸基含量为30％。单糖组成分析表明WS-1岩藻糖的含量为98％;WS-2主要由岩藻糖、糖醛酸和氨基糖组成。结合理化性质与单糖组成分析，推测WS-1为硫酸化的岩藻聚糖，WS-2为硫酸化的糖胺聚糖。经凝胶排阻色谱测定，多糖组分WS-1和WS-2的分子量分别为593kDa和359kDa。　　红外光谱、甲基化分析、二糖组成分析以及核磁共振分析结果表明多糖WS-1组分是由→3）-α-L-Fucp-（1→组成的线性结构，并且在岩藻糖的二位和四位存在硫酸基修饰，其中Fuc2S4S含量为24％，Fuc2S含量为24％，Fuc4S含量为12％，Fuc0S含量为40％，平均8个岩藻糖基存在7个硫酸基修饰;多糖WS-2组分的骨架结构由→3)-β-D-GlcpNAc6S-(1→4)-β-D-GlcpUA-(1→和→3)-β-D-GlcpNAc4S6S-(1→4)-β-D-GlcpUA-(1→组成，并且这两种结构的比例为1.5∶1，在糖醛酸的3位可能连有聚合度为1-6并且带有1-3个硫酸基团的岩藻寡糖，岩藻寡糖的连接方式为→3)-α-L-Fucp-（1→，岩藻糖残基有Fuc2S4S、Fuc3S4S、Fuc0S以及Fuc4S四种类型，其中Fuc3S4S在岩藻糖侧链的末端。　　通过测定APTT、PT和TT评价WS-1和WS-2的体外抗凝血活性，结果表明WS-1组分只能经内源性途径发挥抗凝血作用，而WS-2组分能经内源性以及外源性途径发挥抗凝血作用，并且研究发现WS-2组分还能经抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)介导，抑制凝血因子Ⅱ(FⅡa)和凝血因子Ⅹ(FⅩa)的活性。　　以RAW264.7巨噬细胞为靶细胞，探究多糖组分WS-1对巨噬细胞的免疫调节作用，结果表明其可提高巨噬细胞的吞噬活性并且增加ROS的产生。通过ELISA试剂盒测定WS-1对巨噬细胞分泌细胞因子的影响，结果表明其可提高细胞分泌iNOS，TNF-α，IL-6，IL-12和IL-1β的水平。进一步通过细胞膜受体拮抗实验，推测WS-1能被TLR4受体识别，从而活化巨噬细胞，调节其免疫功能。　　抗病毒结果显示:多糖WS-2组分具有良好的抗HSV1病毒活性，其IC50为14.79±1.10μg/mL，并且其安全指数较大（SI指数为135.23），有进一步研究的价值。　　本实验对东海乌参多糖进行系统的结构以及活性的研究，实验结果为东海乌参的高值化开发提供了重要参考。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1海参的研究概况

1．2海参多糖的结构研究

1．2．1海参岩藻聚糖的结构研究

1．2．2海参硫酸软骨素的结构

1．3海参多糖的生物活性

1．3．1抗凝血活性

1．3．2免疫调节活性

1．3．3降血脂活性

1．3．4抗病毒活性

1．4立项背景及研究意义

第二章东海乌参多糖分离纯化以及理化性质

2．1材料和仪器

2．1．1实验材料

2．1．2实验试剂

2．1．3实验仪器

2．2实验方法

2．2．1东海乌参多糖的提取

2．2．2东海乌参多糖的脱蛋白

2．2．3东海乌参多糖的分离纯化

2．2．4东海乌参多糖纯度分析以及分子量测定

2．2．5东海乌参理化性质分析

2．2．6单糖组成分析

2．3结果与分析

2．3．1东海乌参多糖的提取

2．3．2东海乌参多糖的分离纯化

2．3．3纯度及分子量分析

2．3．4理化性质测定

2．3．5单糖组成分析

2．4小结

第三章东海乌参多糖的结构鉴定

3．1实验试剂及仪器

3．1．1实验试剂

3．1．2实验仪器

3．2实验方法

3．2．1红外光谱分析

3．2．2乌参岩藻聚糖脱硫酸基

3．2．3乌参岩藻聚糖的甲基化分析

3．2．4乌参糖胺聚糖的二糖组成及侧链分析

3．2．5乌参多糖核磁共振(NMR)分析

3．3结果与分析

3．3．1红外光谱分析

3．3．2 WS-1甲基化分析

3．3．3东海乌参糖胺聚糖二糖组成和侧链结构分析

3．3．4核磁共振分析

3．4小结

第四章东海乌参多糖的活性评价

4．1实验试剂及仪器

4．1．1实验材料

4．1．2实验试剂

4．1．3实验仪器

4．2实验方法

4．2．1体外抗凝血活性研究

4．2．2巨噬细胞RAW264．7免疫调节实验

4．2．3抗病毒活性

4．3结果与分析

4．3．1抗凝血活性分析

4．3．2 WS-1对巨噬细胞RAW264．7免疫调节作用分析

4．3．3 WS-1和WS-2抗病毒活性

4．4小结

总结

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文及研究成果