miR-1254表达缺失在乳腺癌中的关键作用

摘要

MicroRNAs(miRNAs)是一类小分子非编码RNA(大约22个核苷酸），主要在RNA沉默和基因的转录后调控过程中发挥功能。通常，一个miRNA通过碱基配对方式与位于mRNA3'端非翻译区的互补序列结合，进而导致mRNA的降解或者翻译抑制。一个miRNA可能调节数百个mRNA，同时多个miRNA也可能靶向同一个mRNA，这种特性赋予了miRNA作为重要调节因子的潜能。
　　乳腺癌中10号染包体长臂上高频基因组拷贝数缺失预示了这一区域中肿瘤抑制基因的存在。为了筛选乳腺癌10号染色体长臂上可能缺失的miRNA，我们采集了20例乳腺癌组织和4例良性乳腺疾病组织，用基因组实时定量PCR检测了由miRbase18.0数据库预测位于这个区域中已知45个miRNA的DNA拷贝数，miR-1254作为缺失频率最高（85％样本缺失）的miRNA被鉴定出来。
　　我们接下来重点探究了miR-1254在ER+乳腺癌细胞中的功能。三条线索证明了miR-1254在乳腺癌中行使着肿瘤抑制功能，第一:miR-1254抑制乳腺癌细胞增殖促进细胞凋亡;第二:miR-1254抑制乳腺癌上皮细胞间充质样转化(EMT)过程及干细胞比例;第三:小鼠移植瘤实验表明，抑制miR-1254在体内可以增强乳腺癌细胞的肿瘤起始能力和原位侵袭、远端转移能力。
　　上皮细胞间充质样转化和干细胞比例的增加往往是ER+乳腺癌细胞对雌激素依赖性降低的标志。与论文之前的结论一致，抑制miR-1254导致ER+乳腺癌细胞生长不再依赖雌激素以及体内体外明显的他莫昔芬抗性。可以想见，在他莫昔芬抗性细胞中恢复miR-1254的表达可以恢复细胞对他莫昔芬的敏感性，并且降低细胞的转移能力和干细胞比例。
　　为了确定miR-1254是通过怎样的机制来行使肿瘤抑制因子功能的，我们首先采用miRanda和TargetScan预测了miR-1254可能的mRNA潜在靶点，进一步的基因聚类分析帮助我们缩小靶点范围并鉴定出NCOA1，NCOA3， EGFR，ERBB2和SNAI1这五个在乳腺癌他莫昔芬抗性和/或上皮细胞间充质样转换过程中已充分报道的基因可能是miR-1254的潜在靶点。进一步的荧光报告、蛋白免疫印记和免疫组织化学实验共同确定了这五个基因确实是miR-1254的靶点。
　　总的来说，本论文证明了miR-1254在乳腺癌中通过同时调控ER/ EGFR/HER2信号通路来实现肿瘤抑制因子的功能，并预示了miR-1254在抗肿瘤及乳腺癌他莫昔芬抗性中的广泛应用前景。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 癌症概述

1．1．1 癌症

1．1．2 癌症的生物学特征

1．1．3 癌症的发生与治疗

1．1．4 癌细胞基因组的不稳定性

1．2 乳腺癌概述

1．2．1 乳腺癌的现状

1．2．2 乳腺癌的致病因素

1．2．3 乳腺癌的分型

1．2．4 乳腺癌的预防与治疗

1．3 miRNA概述

1．3．1 miRNA的概念

1．3．2 miRNA的加工与合成

1．3．3 miRNA的作用机制

1．3．4 miRNA与肿瘤的关系

1．4 他莫昔芬抗性概述

1．4．1 他莫昔芬简介

1．4．2 雌激素受体的作用机制

1．4．3 他莫昔芬抗性的分子机制

第二章 miR-1254在乳腺癌中表达下调

2．1 人10号染色体长臂miRNA基因不稳定性筛查

2．2 miR-1254主要由miR-1254-1基因座产生

2．3 miR-1254在乳腺癌临床样本中表达下调

2．4 miR-1254在乳腺癌细胞中表达下调

2．5 本章小结

第三章 miR-1254抑制乳腺癌细胞增殖

3．1 miR-1254抑制乳腺癌细胞增殖

3．2 miR-1254抑制乳腺癌细胞分裂

3．3 miR-1254促进乳腺癌细胞凋亡

3．4 本章小结

第四章 miR-1254抑制乳腺癌转移和干细胞样行为

4．1 miR-1254抑制乳腺癌细胞转移

4．2 miR-1254抑制乳腺癌细胞干细胞样行为

4．3 本章小结

第五章 miR-1254恢复乳腺癌他莫昔芬敏感性

5．1 抑制miR-1254可以降低ER+乳腺癌细胞雌激素依赖性

5．2 抑制miR-1254使ER+细胞产生他莫昔芬抗药性

5．3 过表达miR-1254可以恢复他莫昔芬敏感性

5．4 本章小结

第六章 miR-1254通过3’UTR直接调控的基因

6．1 生物信息学预测miR-1254靶点

6．2 双荧光素酶报告实验验证靶点

6．3 免疫印迹实验验证靶点

6．4 免疫组织化学实验验证靶点

6．5 本章小结

第七章 总结与讨论

第八章 材料与方法

8．1 乳腺癌临床冷冻组织中抽提miRNA

8．1．1 乳腺癌病人临床冷冻组织样本

8．1．2 实验试剂及仪器

8．1．3 冷冻组织样本中miRNA的抽提

8．2 miRNA的反转录

8．2．1 实验试剂及仪器

8．2．2 反转录实验步骤

8．3 miRNA的quantitive Real-time PCR(qRT-PCR)

8．3．1 实验试剂及仪器

8．3．2 qRT-PCR实验步骤

8．4 细胞内总RNA提取

8．4．1 实验试剂及仪器

8．4．2 TRIZOL法实验步骤

8．4．3 Ambion公司的miRNA抽提试剂盒抽取总RNA实验步骤

8．5 总RNA的RT-PCR

8．5．1 实验试剂及仪器

8．5．2 RT-PCR实验步骤

8．6 总RNA的quantitive Real-time PCR(qRT-PCR)

8．6．1 实验试剂及仪器

8．6．2 qRT-PCR实验步骤

8．7 双荧光报告实验

8．7．1 实验试剂及仪器

8．7．2 双荧光报告实验的原理

8．7．3 双荧光素酶报告载体的构建

8．8 载体的定点突变

8．8．1 实验试剂及仪器

8．8．2 实验步骤

8．9 shRNA载体构建

8．10 其它载体的构建

8．10．1 miR-1254的报告载体

8．10．2 miR-1254五个靶基因3’UTR表达载体

8．10．3 miR-1254 sponge

8．11 质粒中抽

8．12 细胞培养

8．12．1 实验试剂及仪器

8．12．2 细胞日常培养

8．12．3 细胞的冻存与复苏

8．13 他莫昔芬抗性细胞系的构建

8．14 细胞的种板和转染

8．14．1 实验试剂及仪器

8．14．2 细胞的种板

8．14．3 细胞的转染步骤

8．15 MTT(细胞活力测定法)

8．15．1 实验原理

8．15．2 实验试剂及仪器

8．15．3 实验步骤

8．16 软琼脂克隆形成实验(Soft Agar)

8．16．1 实验试剂及仪器

8．16．2 实验步骤

8．17 细胞二维(2D)基质胶(matrigel)培养

8．17．1 实验原理

8．17．2 实验试剂及仪器

8．17．3 实验步骤

8．18 细胞克隆形成实验

8．18．1 实验原理

8．18．2 实验试剂及仪器

8．18．3 实验步骤

8．19 细胞单层培养克隆形成实验(monolayer culture)

8．19．1 实验原理

8．19．2 实验试剂及仪器

8．19．3 实验步骤

8．20 细胞球囊悬浮培养(mammosphericgrowth)

8．20．1 实验原理

8．20．2 实验试剂及仪器

8．20．3 实验步骤

8．21 细胞迁移(Transwell Assay-Migration)实验

8．21．1 实验原理

8．21．2 实验试剂及仪器

8．21．3 实验步骤

8．22 流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)

8．22．1 实验原理

8．22．2 实验试剂及仪器

8．22．3 实验步骤

8．23 蛋白印记法(western blot)

8．23．1 实验试剂及仪器

8．23．2 实验步骤

8．24 稳转细胞系的构建

8．24．1 实验试剂及仪器

8．24．2 实验步骤

8．25 裸鼠体内荷瘤实验

8．25．1 实验试剂及仪器

8．25．2 实验步骤

8．26 免疫组织化学IHC

8．26．1 实验试剂及仪器

8．26．2 实验步骤

8．27 苏木精—伊红染色法(HE染色)

8．28 脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(TUNEL)

8．28．1 实验试剂及仪器

8．28．2 实验步骤

参考文献

附录

致谢

在读期间发表的论文与取得的研究成果