渗透压和Ca2+调控椎间盘髓核细胞中CCN2/CTGF的表达和机制研究

摘要

一、研究背景　　下腰痛是中国临床脊柱外科门诊中最常见的病人就诊原因之一，也是全世界发病率最高的骨骼肌肉系统疾病。在过去的25年里，下腰痛的患病率和致残率显著增加，总发病率在35-55岁的年龄范围内达到顶峰，并可能随着人口老龄化而进一步增加。疾病发生时，患者活动能力受到限制，严重者无法实现正常的生理功能和日常生活，影响生活质量，甚至导致残疾。流行病学研究表明，在导致下腰痛的诸多因素里，椎间盘退变是最主要的原因之一。现有的治疗方案其目的多是对症治疗，以缓解症状，却无法从根本上扭转椎间盘退变的趋势。因此，深入研究椎间盘组织的生理机制和病理过程，从中探索发现潜在的生物治疗靶点，实现椎间盘组织结构和生物力学功能的重塑，可能成为椎间盘退变治疗新的突破点。　　椎间盘组织的微环境与体内其他组织存在显著差异，其特点是低pH值、低葡萄糖浓度、低氧浓度和高渗透压，其中高渗透压是健康椎间盘组织微环境中最为独特和重要的理化环境之一。研究发现，在椎间盘老化和退变过程中，髓核组织细胞外基质合成减少、降解加快，导致椎间盘内的渗透压下降明显，并因此引起一些列病理生理反应，加速椎间盘组织内炎症的发生和退变的进展。Ca2+是人体内最为普遍的信号传导因子，在椎间盘和软骨等组织中，应力负荷的改变常伴随组织渗透压的变化，这些刺激导致细胞内的Ca2+浓度升高，Ca2+信号通路激活，调整细胞内的基因表达和蛋白合成，对渗透压和应力负荷的改变做出反应。研究表明，基质细胞蛋白CCN2(Connective tissue growth factor，CTGF)是髓核组织中最重要的促合成代谢细胞因子之一，同时也是髓核组织中调节细胞与细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)相互作用的重要因素，与TGF-β和Hif-1α均存在复杂的调控关系。在介导细胞与周围微环境之间的信号传导和交流的过程中，其作用和功能具有多样性。深入了解其表达和调控机制，针对其进行靶向治疗，有可能延缓年龄相关性退变的发生，抑或促进早期椎间盘退变的及时修复。目前关于渗透压和细胞内Ca2+浓度变化对CCN2表达的影响和相关分子机制暂无研究。　　本研究拟对CCN2在不同等级退变椎间盘组织中的表达水平变化、渗透压和细胞内Ca2+浓度的改变对CCN2表达的影响和调控机制进行深入研究和探讨。　　二、研究目的　　1、探讨CCN2在不同退变等级椎间盘组织中的表达差异;　　2、体外模拟正常椎间盘组织渗透压和退变椎间盘组织渗透压，研究渗透压变化对髓核细胞中CCN2表达的影响及其可能的调控机制;　　3、探讨细胞内Ca2+浓度变化对髓核细胞中CCN2表达的影响及其可能的调控机制。　　三、研究方法　　第一部分　　1、临床退变椎间盘样本收集、分析和检测:总共收集20例腰椎手术患者的退变椎间盘组织样本34个，根据Pfirrmann分级，其中13个样本为轻度退变，21个样本为重度退变。通过免疫组化、阳性细胞计数和Real time PCR分析CCN2在不同退变等级的椎间盘髓核组织中的表达水平差异。　　2、大鼠髓核细胞分离、提取和原代培养，并通过Western blot和免疫荧光明确CCN2在大鼠髓核细胞中表达和细胞定位情况。　　第二部分　　1、采用不同渗透压浓度的培养基对髓核细胞进行渗透压浓度梯度和时间梯度干预，通过Real time PCR、Western blot和免疫荧光分析髓核细胞中CCN2在转录和翻译水平的表达变化和细胞定位情况。　　2、将CCN2启动子报告基因质粒转染至髓核细胞中，渗透压梯度干预后，检测CCN2在启动子水平的变化。　　3、通过进化保守区基因数据库分析人、大鼠等多种脊椎动物CCN2基因序列的保守性和相似度，并通过JASPAR核心数据库预测可能的启动子结合位点和调控机制。　　4、检测渗透压下游经典转录因子TonEBP在大鼠髓核细胞中的表达情况并验证渗透压对TonEBP表达的调控作用。　　5、构建TonEBP表达质粒，对转录因子TonEBP进行Gain and loss of function实验，采用Dual Luciferase报告基因系统和Western blot法进一步确认渗透压调控CCN2表达通过转录因子TonEBP进行。　　第三部分　　1、使用Ionomycin和PMA提高细胞内Ca2+浓度，通过Western blot、免疫荧光和Dual Luciferase报告基因检测CCN2在转录、翻译和启动子水平的变化。通过Ca2+螯合剂验证Ca2+离子在调控CCN2中的作用。使用免疫抑制药物FK506和CsA抑制钙调磷酸酶活性，检测其在调控CCN2中的作用。　　2、将钙调磷酸酶的两个亚基CnA和CnB表达质粒与CCN2启动子报告基因质粒共转染至髓核细胞，通过Western blot和Dual Luciferase报告基因等方法验证钙调磷酸酶在CCN2表达调控中的作用。　　3、分别将NFAT1-4表达质粒转染至髓核细胞中，通过报告基因检测系统研究各个NFAT转录因子在调控CCN2启动子活性中的作用。　　4、通过免疫荧光技术验证NFAT在髓核细胞中的表达和定位，同时验证髓核细胞中Ca2+对NFAT调控作用。　　四、研究结果　　1、CCN2在人严重退变椎间盘组织中的表达水平高于轻度退变椎间盘组织;CCN2在大鼠髓核细胞中表达明确;　　2、高渗透压抑制髓核细胞中CCN2表达，该调控作用通过转录因子TonEBP进行;脊椎动物的CCN2基因序列高度保守;　　3、细胞内Ca2+浓度升高可通过Ca2+-钙调磷酸酶-NFAT信号通路促进髓核细胞中CCN2的表达;NFAT在髓核细胞中表达明确，且受细胞内Ca2+浓度变化调控。　　五、研究结论　　1、CCN2在严重退变椎间盘组织中的表达水平显著高于轻度退变椎间盘组织;　　2、本研究发现，当髓核细胞处于高渗透压环境中时，髓核细胞通过TonEBP抑制CCN2的表达;与此同时，组织高渗透压促进Ca2+内流，细胞内Ca2+浓度升高，通过Ca2+-钙调磷酸酶-NFAT信号通路上调CCN2的表达，两条调控途径互相牵制达到平衡，避免髓核细胞中CCN2过多累积，实现对CCN2表达的精细调控，有利于维持髓核组织内环境的稳态。退变过程中椎间盘组织渗透压下降，失去对CCN2表达的抑制作用，可能是CCN2在退变椎间盘中表达升高，积聚并导致组织纤维化的病理机制。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

第一部分CCN2在人体退变髓核组织和大鼠椎间盘细胞中的表达与分析

一、前言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论与结论

参考文献

第二部分渗透压调控大鼠髓核细胞中CCN2的表达及其分子机制研究

一、前言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论与结论

参考文献

第三部分细胞内Ca2+调控大鼠髓核细胞中CCN2的表达及其分子机制研究

一、前言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论与结论

参考文献

全文结论

综述

在读期间科研成果

致谢