利用CRISPR/Cas9技术筛选鉴定肾癌依维莫司耐药新靶点MAGIX

摘要

目的:　　临床上mTOR抑制剂应用于多种肿瘤的治疗，以依维莫司在转移性肾癌治疗中的应用较为广泛。但实际应用中疗效个体差异较大，耐药现象较为常见，大大限制了其疗效。在mTOR抑制剂耐药机制中，肿瘤的遗传学改变与之关系密切。现有相关研究多局限于从有限差异疗效病例中寻找耐药相关基因靶点，尚缺乏从全基因组水平评估基因的功能改变与mTOR抑制剂药敏之间相关性。而CRISPR/Cas9技术的发展应用为研究基因功能提供了巨大的便捷。将采用CRISPR/Cas9文库筛选的方法，从全基因组水平筛选mTOR抑制剂耐药相关靶点，并进行靶点功能验证及临床相关性分析，以期为逆转mTOR抑制剂耐药提供新的理论和依据。　　方法:　　1、通过质粒文库扩增、病毒文库制备、筛选条件摸索、耐药筛选等过程建立肾癌依维莫司耐药靶点CRISPR/Cas9筛选模型，并进行高通量测序。　　2、利用MAGeCK等一系列生物信息学方法，进行测序数据的质控和分析，结合体外耐药细胞株转录组测序分析，筛选若干潜在耐药靶点;　　3、利用CRISPR敲除、质粒转染方法，结合药敏实验、平板克隆和凋亡实验等，对靶点进行进一步的功能验证;　　4、利用实时定量PCR的方法，在接受依维莫司治疗的肾癌组织标本中验证耐药靶点表达水平与临床疗效的相关性;　　5、利用组织芯片的方法，结合临床数据库数据，分析新型靶点在评价肾癌预后中的临床价值。　　结果:　　通过CRISPR/Cas9耐药基因筛选、生信分析、临床疗效相关性分析以及药敏功能验证，发现，靶向敲除MAGIX后能够介导肾癌依维莫司耐药，而过表达则能逆转该过程。较正常肾癌细胞肾，在同样浓度依维莫司作用下，靶向敲除MAGIX后，细胞克隆形成能力明显增强，而凋亡细胞比例明显减少。同时，组织芯片分析和TCGA数据库分析发现，在肾癌患者整体人群中，MAGIX表达水平越低提示患者预后越差。　　结论:　　MAGIX的差异表达水平与肾癌依维莫司治疗药物反应性相关，可作为指导肾癌依维莫司个体化治疗的生物标记物。在临床病理标本中发现，MAGIX在依维莫司耐药组中表达水平低于敏感组。此外，MAGIX的低表达提示肾癌患者预后差，具有预测肾癌预后的潜在临床价值，相关作用机制尚需进一步探讨明确。

目录

声明

摘要

主要英文缩略词表

前言

二、CRSIPR/Cas9在耐药机制研究中的应用

三、研究思路

第一部分 CRISPR/Cas9筛选肾癌依维莫司耐药靶点模型的建立及初步分析

一、材料及仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

第二部分 潜在耐药基因的功能验证及临床相关性分析

一、材料及仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

参考文献

综述

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢