肝脏驻留NK细胞肝内发育途径及其与粘膜ILC1s关系研究

摘要

肝脏作为天然免疫优势器官，存在高比例的天然免疫细胞，包括NK细胞、NKT细胞、γδT细胞和Kuffer细胞。我们实验室的研究发现成年小鼠肝脏可根据CD49a和DX5的不同表达将其分为CD49a-DX5+的传统NK细胞(conventionalNK cells, cNKs)和CD49a+DX5-的肝脏驻留NK细胞(liver-resident NK cells，LrNKs)。与cNKs不同，LrNKs不参与外周循环并驻留于肝窦组织中，故将其定义为肝脏驻留NK细胞。LrNKs在胚胎肝脏造血时期及新生小鼠时期就高比例存在于肝脏，随着小鼠的发育成熟比例逐渐降低，直至成年期维持在50％左右。然而关于LrNKs的发育来源还没有研究清楚。在骨髓细胞转输小鼠模型中，骨髓细胞重建出的LrNKs的比例和数量与正常鼠相比显著下降。在长期连体小鼠中也发现，LrNKs依然保持都是宿主本身来源，说明骨髓造血并不是LrNKs的主要来源。
　　在小鼠个体发育过程中，胚胎肝脏是HSCs增殖和分化的主要场所，成年期肝脏依然保留有少量HSCs。成年肝脏中的Lineage-(Lin-)造血前体细胞具有分化形成正常数量LrNKs的潜能，这些都暗示LrNKs可能存在独特的肝内发育途径。
　　由于LrNKs表达NCR并在发育上依赖IL-15信号，所以一直将其看作NK细胞的一个亚群。最近的研究发现LrNKs和粘膜ILC1s的发育都严格依赖转录因子T-bet而不依赖Eomes，这与cNKs的发育是不一致的。并且LrNKs和粘膜ILC1s发育来源于共同的前体细胞Id2+CHILP(common helper-like progenitors，CHILP)。基于发育上的相似性，很多学者将LrNKs称为辅助样肝脏ILC1s。但是两者在表型、功能和迁移特性方面是否也具有相似性还没有研究清楚。
　　针对以上切入点，我们的研究分为以下两个部分:
　　Ⅰ.肝脏驻留NK细胞的肝内发育途径研究
　　1.成年小鼠肝脏中存在造血干细胞
　　通过集落形成实验我们发现成年肝脏单个核细胞能够形成髓系细胞和红系细胞集落。此外，在成年肝脏中存在着一群表型为Lin-Sca-1+c-kit+的细胞，这群细胞具有长期造血重建能力并且可重建受者鼠淋巴系及髓系细胞，说明成年肝脏依然存在HSCs。
　　2.成年肝脏中CD45+Lin-Mac-1+Sca-1+造血祖细胞来源于胚胎肝脏造血成年肝脏仍然保留有造血潜能，并且存在一群CD45+Lin-Mac-1+Sca-1+(LMS)造血祖细胞，其表型不同于成年骨髓但是类似于胚胎肝脏HSCs。并且在胚胎肝脏和骨髓细胞重建实验中也可以看到，只有胚胎肝脏细胞可以重建出正常比例和绝对数的成年肝脏LMS细胞，而骨髓细胞则不可以。说明成年肝脏LMS细胞是由胚胎肝脏造血来源的。
　　3.成年肝脏LMS细胞拥有造血潜能并能发育形成肝脏驻留NK细胞
　　通过转输实验我们发现与新生小鼠肝脏LMS细胞类似，成年肝脏LMS细胞具有向各谱系细胞分化的潜能，并且分化形成的细胞主要是CD3+T细胞。LrNKs的发育起源于胚胎肝脏造血时期，并且在胚胎和新生小鼠肝脏中的NK细胞绝大部分都是LrNKs。转输成年肝脏LMS细胞后，在受者小鼠肝脏中可以发育形成LrNKs，而不形成cNKs。成年肝脏LMS细胞的这种造血潜能及向LrNKs发育的能力均与胚胎肝脏造血来源的HSCs保持一致。
　　4.成年肝脏CD49a+NKPs特异地分化形成肝脏驻留NK细胞
　　成年小鼠肝脏、骨髓和脾脏中都存在NKPs，但是只有成年肝脏中的NKPs高表达CD49a。我们转输成年小鼠肝脏CD49a+NKPs后发现，仅在受者鼠的肝脏中能检测到供者发育来源的NK细胞，在受者脾脏和骨髓中均检测不到，并且在受者肝脏中发育形成的均是CD49a+DX5-LrNKs。
　　结论Ⅰ:成年小鼠肝脏依然保留有造血潜能，并且存在少量胚胎肝脏来源的CD45+Lin-Mac-1+Sca-1+(LMS)造血祖细胞。成年肝脏LMS细胞的造血潜能与胚胎肝脏HSCs类似，都可在肝脏中仅发育形成LrNKs而不产生cNKs，并且向LrNKs的发育过程需经历CD49a+NKPs阶段。因此，我们发现LrNKs存在特殊的肝内发育途径。
　　Ⅱ.肝脏驻留NK细胞与粘膜ILC1s对比分析
　　1.肝脏驻留NK细胞表型不同于粘膜ILC1 s
　　LrNKs的比例和绝对数都显著高于小肠固有层ILC1 s(small intestine laminapropria ILC1 s，siLP ILC1s)，但是小肠固有层中ILC的种类更加丰富，存在一定量的ILC2s和ILC3s。对表型的检测我们发现，siLPILC1s表达IL-7Rα和CD27，而LrNKs几乎不表达IL-7Rα，部分表达CD27。在迁移相关受体方面，LrNKs特异的高表达向肝脏归巢的受体CXCR6，而siLP ILC1s特异的高表达向小肠迁移的受体CCR9。
　　2.肝脏驻留NK细胞和粘膜ILC1s发育上都依赖转录因子T-bet和NFIL3
　　在Tbx21-/-小鼠中，LrNKs和siLP ILC1 s都不存在，说明两者在发育上都严格依赖于转录因子T-bet。在Nfil3-/-小鼠中，LrNKs依然存在，但是绝对数显著降低，而cNKs细胞是缺失的。小肠固有层中的ILC1s，cNKs和NKp46+ILC3s绝对数都减少，这与NFIL3调控ILC共同前体细胞的发育是一致的。
　　3.粘膜ILC1s具有组织驻留特性
　　CD45.1+与CD45.2+B6小鼠连体实验发现siLP ILC1s和NKp46+ILC3s都不参与外周血液循环，与肝脏CD49a+DX5-NK细胞类似具有组织驻留的特性。
　　4.肝脏驻留NK细胞相比于粘膜ILC1s有更高的细胞毒活性
　　LrNKs在PMA/Ion刺激下会产生大量杀伤功能相关分子:perforin和Granzyme B，其能力与cNKs相似，显著高于siLP ILC1s。并且LrNKs相对于cNKs和siLPILC1s都高表达杀伤功能相关分子:TRAIL和FasL，说明肝脏驻留NK细胞也可以通过TRAIL和FasL来诱导靶细胞的凋亡。对靶细胞Yac-1的直接杀伤实验也证实LrNKs相比于cNKs具有更高的杀伤能力。
　　结论Ⅱ:LrNKs和粘膜ILC1s粘附分子的表达及细胞毒活性方面都存在显著的不同。特别是相比于粘膜ILC1s，LrNKs具有强大的杀伤能力并具有独特的杀伤途径，这也是我们不建议将LrNKs归类为无杀伤能力的ILC1s的重要证据。

目录

声明

摘要

图序

表序

符号说明

第1章 绪论

1．1 肝脏是重要的免疫器官

1．1．1 肝脏是天然免疫优势器官

1．1．2 肝脏是免疫豁免器官

1．2 肝脏是重要的髓外造血器官

1．2．1 造血干细胞的概念

1．2．2 胚胎早期造血

1．2．3 胚胎肝脏造血

1．2．4 成年骨髓造血

1．2．5 成年肝脏造血

1．3 肝脏NK细胞

1．3．1 肝脏NK细胞亚群

1．3．2 NK细胞的发育来源

1．3．3 NK细胞发育的转录调控

1．3．4 肝脏NK细胞的组织驻留特性

1．3．5 肝脏NK细胞的功能

1．4 粘膜ILC1s

1．4．1 ILC1s的发育来源

1．4．2 ILC1s的转录调控

1．4．3 ILC1s的功能

1．4．4 肝脏驻留NK细胞和ILC1s的对比分析

第2章 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 小鼠实验有关试剂

2．1．3 小鼠基因型检测有关试剂

2．1．4 单个核细胞分离有关试剂及配制方法

2．1．5 小肠固有层细胞分离有关试剂及材料

2．1．6 细胞培养有关试剂

2．1．7 集落形成实验有关试剂及材料

2．1．8 NK细胞杀伤实验有关试剂

2．1．9 流式细胞术有关试剂

2．2 实验仪器

2．2．1 小鼠实验相关手术器械

2．2．2 其他主要仪器和设备

2．3 实验方法

2．3．1 细胞系培养

2．3．2 小鼠基因型鉴定

2．3．3 胚胎期小鼠实验

2．3．4 小鼠单个核细胞分离

2．3．5 流式细胞术检测细胞表面分子

2．3．6 流式细胞术检测细胞胞内分子

2．3．7 集落形成实验

2．3．8 细胞分选

2．3．9 造血重建模型

2．3．10 细胞转输模型

2．3．11 小鼠连体实验

2．3．12 NK细胞杀伤实验

2．3．13 统计学分析

第3章 肝脏驻留NK细胞的肝内发育途径研究

3．1 引言

3．2 实验结果

3．2．1 成年肝脏中存在造血干细胞

3．2．2 成年肝脏Lin-Mac-1+Sca-1+(LMS)细胞来源于胚胎肝脏造血

3．2．3 成年肝脏LMS细胞具有造血潜能并能够发育形成LrNKs

3．2．4 成年肝脏中CD49a+NKPs特异地分化形成LrNKs

3．3 小结与讨论

第4章 肝脏驻留NK细胞与粘膜ILC1s关系研究

4．1 引言

4．2 实验结果

4．2．1 LrNKs表型不同于粘膜ILC1s

4．2．2 LrNKs和粘膜ILC1s发育上都依赖T-bet和NFIL3

4．2．3 粘膜ILC1s具有组织驻留特性

4．2．4 LrNKs相比于粘膜ILC1s拥有更高的细胞毒活性

4．3 小结与讨论

参考文献

致谢

攻读博士学位期间的主要研究成果