T细胞或NK细胞的制造方法、T细胞或NK细胞的培养用培养基、T细胞或NK细胞的培养方法、维持未分化T细胞的未分化状态的方法和T细胞或NK细胞的增殖促进剂

摘要

本发明的目的在于，提供能够使T细胞或NK细胞高效地增殖并且维持该细胞的状态(例如未分化性)的T细胞或NK细胞的制造方法、T细胞或NK细胞的培养用培养基、T细胞或NK细胞的培养方法、维持未分化T细胞的未分化状态的方法和T细胞或NK细胞的增殖促进剂。本发明涉及T细胞或NK细胞的制造方法等，其包括如下步骤：在含有式(X‑1)或式(X‑2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐的培养基中培养T细胞或NK细胞。

说明书

技术领域

本发明涉及T细胞或NK细胞的制造方法、T细胞或NK细胞的培养用培养基、T细胞或NK细胞的培养方法、维持未分化T细胞的未分化状态的方法和T细胞或NK细胞的增殖促进剂。

背景技术

T细胞为源自造血干细胞的免疫细胞之一。T细胞在细胞表面表达T细胞受体(TCR)，特异性识别靶细胞上的HLA-肽复合物。另外，T细胞能够通过TCR介导的增殖信号进行增殖。T细胞大致分为辅助性T细胞(Th细胞)和细胞毒性T细胞(CTL)，在体内协同工作。

对肿瘤的免疫应答(抗肿瘤免疫应答)主要由直接杀伤肿瘤的CTL和增强CTL的功能的Th细胞构成。另一方面认为，树突状细胞(DC)具有作为调整其它免疫细胞的动态的指挥官的作用，Th细胞通过DC的活化而活化CTL，从而发挥抗肿瘤效果。

在使用抗肿瘤免疫应答的癌症治疗方法中，使用作为效应细胞起作用的、肿瘤相关抗原特异性CTL等的过继免疫疗法是也发挥使原发癌缩小、抑制转移或复发的效果且对正常组织的副作用小的治疗方法。

认为在过继免疫疗法中，由诱导性多能干(iPS)细胞等多能干细胞诱导的T细胞也与通过将该T细胞给药于生物体内而引起强烈的抗肿瘤免疫应答的细胞免疫疗法有关，并对此进行了开发(专利文献1、非专利文献1)。例如，专利文献1和非专利文献1中记载的方法为由抗原特异性CD8阳性CTL制作iPS细胞、再分化诱导为CD8阳性CTL的方法。

由多能干细胞诱导的T细胞与在生物体内的持续性高低和应答相关(非专利文献3)，T细胞的未分化状态越高，显示出越高的治疗效果(非专利文献4)。

但是，在由多能干细胞诱导的T细胞的培养中，通常使用源自健康人供体等的细胞作为饲养细胞，担心未知成分以未知浓度混入，存在感染的风险或成本的问题，已成为临床应用中的课题(非专利文献2)。

自然杀伤(NK)细胞占血细胞的约10％左右，是在免疫反应中发挥重要作用的淋巴样细胞之一。NK细胞可发挥各种功能，特别是具有杀伤癌细胞或者杀伤被从外部入侵的病原菌或病毒感染的细胞等的能力，发挥清除肿瘤化或肿瘤化过程中的异常细胞的作用。

另外，NK细胞还作为抗体药物识别肿瘤细胞等、在患者体内发挥抗体依赖性细胞毒活性时的效应细胞而发挥功能。NK细胞与T细胞同样地能够通过导入嵌合抗原受体(CAR)或TCR而被赋予特异性、对癌细胞等显示出特异性的细胞毒活性(非专利文献5)。

尽管如上所述NK细胞有可能作为癌症或感染性疾病的治疗剂，但是存在于患者体内的NK细胞数并不多。因此，需要可以在使NK细胞保持能够用于治疗用途程度的充分的疗效的同时还可以大量生产NK细胞的技术。

但是，与T细胞相比，NK细胞不能在体外大量增殖和培养，因此，对用于将NK细胞增殖和培养至对治疗有用的水平的技术进行了很多研究。

例如，关于NK细胞的培养，已经进行了不仅使用用于T细胞增殖/活化的IL-2、而且使用对IL-21、LPS(非专利文献6)或CD3进行刺激的OKT-3抗体(非专利文献7)的增殖或活化方法的研究。但是，这些仅仅是在以往所使用的IL-2的使用的变形和改进方式中发现了新的增殖物质。

另外，还开发了组合有IL-12、IL-15或IL-18的NK细胞培养方法(非专利文献8)。另外，还开发了在NK细胞的培养中使用自体或同种的饲养细胞的方法。

但是，依然没有发现在质量管理、安全性或成本等方面优良的使用低分子化合物等的划时代的NK细胞增殖方法。

双苄基异喹啉生物碱是源自天然存在的药效材料的低分子化合物。双苄基异喹啉生物碱中，例如小檗胺等已被用作临床药物。

已知小檗胺是千金藤素制剂的成分之一，具有对癌细胞的细胞增殖抑制作用，显示出抗肿瘤效果(非专利文献9)。另外，已知小檗胺具有刺激骨髄细胞增殖、改善造血干细胞集落刺激因子(GCSF)的水平、促进骨髄造血干细胞和骨髄祖细胞的增殖和向粒细胞的分化、以及促进白细胞增殖的效果(专利文献2)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2011/096482号

专利文献2：日本特表2013-537171号公报

非专利文献

非专利文献1：Nishimura T,et al.,Cell Stem Cell.12(1):114-126,2013

非专利文献2：Takayama N,et al.,Journal of Experimental Medicine,207(13):2817-2830,2010

非专利文献3：Porter et al.,Science Translational Medicine.7(303):303ra139,2015

非专利文献4：Nicholas P.Restifo,Blood.124(4):476-477,2014

非专利文献5：Li Y,et al.,Cell Stem Cell,23(2):181-192,2018

非专利文献6：J.Immunol.,165(1):139-147,2000

非专利文献7：Experimental Hematol.,29(1):104-113,2001

非专利文献8：Front.Immunol.,8(458):1-18,2017

非专利文献9：Ying Gu et al.,Blood,120(24):4829-4839,2012

发明内容

发明所要解决的问题

如上所述，需要可以在使T细胞或NK细胞保持能够用于治疗用途程度的充分的疗效的同时还可以大量生产T细胞或NK细胞的技术。但是，上述的公知方法仅仅是以往所使用的IL-2等的使用的变形和改进方式，尚未发现达到能够应用于治疗的水平的、划时代的增殖或活化方法。另一方面，对于小檗胺等双苄基异喹啉生物碱所带来的T细胞或NK细胞的增殖促进效果和维持该细胞的状态(例如未分化性)的效果，迄今为止尚没有任何了解。

本发明的目的在于，提供能够使T细胞或NK细胞高效地增殖并且维持该细胞的状态(例如未分化性)的T细胞或NK细胞的制造方法、T细胞或NK细胞的培养用培养基、T细胞培养方法、维持未分化T细胞的未分化状态的方法和T细胞或NK细胞的增殖促进剂。

用于解决问题的方法

本发明人为了达到上述目的反复进行了深入研究，结果发现，式(X-1)或(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐具有对T细胞或NK细胞的优良的增殖促进效果和维持该细胞的状态(例如未分化性)的效果，从而完成了本发明。

即，本发明提供以下的发明。

1.一种T细胞或NK细胞的制造方法，其包括如下步骤：在含有下述式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐的培养基中培养T细胞或NK细胞。

[式(X-1)和式(X-2)中，

R

R

R

X

2.根据上述1所述的制造方法，其中，上述T细胞或NK细胞为用于免疫细胞疗法的T细胞或NK细胞。

3.根据上述1或2所述的制造方法，其中，上述T细胞或NK细胞为源自外周血的细胞、源自原代造血干细胞/祖细胞的细胞、或者源自多能干细胞的细胞。

4.根据上述1～3中任一项所述的制造方法，其中，上述T细胞为未分化T细胞。

5.根据上述1～4中任一项所述的制造方法，其中，上述T细胞表达CD4和CD8中的至少一者。

6.根据上述1～5中任一项所述的制造方法，其中，上述T细胞为选自由辅助性T细胞、调节性T细胞、细胞毒性T细胞、初始T细胞、记忆性T细胞和终末效应T细胞组成的组中的1种。

7.根据上述6所述的制造方法，其中，上述调节性T细胞表达FoxP3。

8.根据上述6所述的制造方法，其中，上述记忆性T细胞为干细胞样记忆性T细胞、中央记忆性T细胞或效应记忆性T细胞。

9.根据上述1～3中任一项所述的制造方法，其中，上述NK细胞为未成熟NK细胞或成熟NK细胞。

10.根据上述1～9中任一项所述的制造方法，其中，上述双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐为选自小檗胺、(+)-小檗胺、E6-小檗胺、千金藤素及其药学上可接受的盐中的至少1种。

11.根据上述1～10中任一项所述的制造方法，其中，上述培养基中的上述双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐的浓度为0.1nM～10μM。

12.根据上述1～11中任一项所述的制造方法，其中，上述培养基还含有MAPK级联抑制剂。

13.根据上述1～12中任一项所述的制造方法，其中，上述培养基中不含饲养细胞。

14.根据上述1～13中任一项所述的制造方法，其中，进行上述培养的时间为50天以上。

15.一种T细胞或NK细胞，其通过上述1～14中任一项所述的制造方法制造。

16.一种免疫细胞疗法剂，其含有上述15所述的T细胞或NK细胞。

17.一种用于培养T细胞或NK细胞的培养基，其含有下述式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐。

[式(X-1)和式(X-2)中，

R

R

R

X

18.根据上述17所述的培养基，其中，上述T细胞或NK细胞为源自外周血的细胞、源自原代造血干细胞/祖细胞的细胞、或者源自多能干细胞的细胞。

19.根据上述17或18所述的培养基，其中，上述双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐为选自小檗胺、(+)-小檗胺、E6-小檗胺和千金藤素及其药学上可接受的盐中的至少1种。

20.根据上述17～19中任一项所述的培养基，其中，上述双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐的浓度为0.1nM～10μM。

21.根据上述17～20中任一项所述的培养基，其中，还含有MAPK级联抑制剂。

22.一种T细胞或NK细胞的培养方法，其中，在含有下述式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐的培养基中培养T细胞或NK细胞。

[式(X-1)和式(X-2)中，

R

R

R

X

23.根据上述22所述的培养方法，其中，上述T细胞或NK细胞为源自外周血的细胞、源自原代造血干细胞/祖细胞的细胞、或者源自多能干细胞的细胞。

24.根据上述22或23所述的培养方法，其中，上述双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐为选自小檗胺、(+)-小檗胺、E6-小檗胺和千金藤素及其药学上可接受的盐中的至少1种。

25.根据上述22～24中任一项所述的培养方法，其中，上述培养基中的上述双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐的浓度为0.1nM～10μM。

26.一种维持未分化T细胞的未分化状态的方法，其包括如下步骤：在含有下述式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐的培养基中培养所述未分化T细胞。

[式(X-1)和式(X-2)中，

R

R

R

X

27.一种T细胞或NK细胞的增殖促进剂，其含有下述式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分。

[式(X-1)和式(X-2)中，

R

R

R

X

28.一种T细胞或NK细胞的制造方法，其包括用含有CaMKII抑制剂的培养基培养T细胞或NK细胞的步骤。

29.根据上述28所述的制造方法，其中，CaMKII抑制剂为下述式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐。

[式(X-1)和式(X-2)中，

R

R

R

X

发明效果

根据本发明，通过在式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐的存在下培养T细胞或NK细胞，能够在维持该细胞的状态(例如未分化性)的同时使其高效地增殖。因此，根据本发明，可提供能够更安全且低成本地生产显示出优良的生物体持续性的T细胞或NK细胞的T细胞或NK细胞的制造方法、T细胞或NK细胞的培养用培养基、T细胞或NK细胞的培养方法、维持未分化T细胞的未分化状态的方法和T细胞或NK细胞的增殖促进剂。

附图说明

图1示出iPS细胞的分化诱导的步骤的示意图。

图2示出使iPS-T细胞增殖的步骤的示意图。

图3A示出使用T-iPS-T细胞的免疫表型检查的步骤的示意图。

图3B示出使用T-iPS-T细胞的免疫表型检查的结果。

图4(A)示出使用T-iPS-T细胞的免疫表型检查的步骤的示意图，图4(B)示出其结果。

图5(A)～(C)示出筛选在无饲养细胞培养条件下改善T-iPS-T细胞的增殖效率的低分子化合物的方案。

图6示出以活细胞数为指标筛选在无饲养细胞培养条件下促进T-iPS-T细胞增殖的低分子化合物的结果。

图7示出筛选在无饲养细胞培养条件下维持未分化的T细胞的未分化性的同时促进细胞增殖的低分子化合物的结果。

图8示出无饲养细胞培养条件下的、小檗胺及其衍生物对活细胞数的浓度依赖性评价的结果。

图9示出无饲养细胞培养条件下的、小檗胺及其衍生物对未分化细胞数的浓度依赖性评价的结果。

图10(A)和(B)示出使用T-iPS-T细胞对使用PBMC饲养细胞的刺激方法、使用CD3/CD28 Dynabeads(免疫磁珠)的刺激方法、以及在CD3/CD28 Dynabeads基础上加入小檗胺1μM的刺激方法这3种方法进行比较的结果。

图11示出以活细胞数为指标分析在无饲养细胞培养条件下低分子化合物对T-iPS-T细胞增殖的影响的结果。

图12(A)和(B)示出对有助于记忆性T细胞增殖的已知化合物与小檗胺在T-iPS-T细胞的培养中的影响进行比较并评价的结果。

图13示出小檗胺与MAPK级联抑制剂的组合使用对记忆性T细胞增殖的效果的研究结果。

图14(A)示出通过使用小檗胺来评价T-iPS-T细胞的无饲养细胞长期培养的实验方案，图14(B)示出其结果。

图15(A)示出通过使用小檗胺来评价T-iPS-T细胞的饲养细胞长期培养的实验方案，图15(B)示出其结果。

图16(A)示出评价小檗胺给原代T细胞(CD4T、CD8T细胞)的增殖带来的影响的实验方案，图16(B)和(C)示出其结果。

图17(A)和(B)示出检验小檗胺在调节性T细胞(Treg)的增殖中的有用性的结果。

图18A为示出T细胞的阶段性的示意图。

图18B为检验小檗胺在T细胞内起作用的级分的结果，示出分选时的门控。

图18C为检验小檗胺在T细胞内起作用的级分的结果，示出细胞计数。

图19(A)示出研究与小檗胺一起培养的细胞给在小鼠中的植活带来的影响的实验方案，图19(B)示出其结果。

图20(A)示出研究小檗胺对NK细胞的作用的实验方案，图20(B)和(C)示出其结果。图20(B)示出NK细胞纯化前后的FACS图。图20(C)示出培养后的细胞数。

具体实施方式

[T细胞或NK细胞的制造方法]

本发明的T细胞或NK细胞的制造方法包括下述步骤：在含有式(X-1)或(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐的培养基(以下也称为本发明的用于培养T细胞或NK细胞的培养基)中，培养T细胞或NK细胞。

[式(X-1)或(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱]

对本发明中的下述式(X-1)或(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物进行说明。

式(X-1)和(X-2)中，

R

R

R

X

本发明中，酰基是指RC(＝O)-，R可以为含有1～10个碳原子的直链状或支链状的烷基、芳基或杂环中的任一者，它们可以进一步具有取代基。

本发明中，酰氧基是指RC(＝O)O-，R与上述相同。

本发明中，磺酰氧基是指RS(＝O)

本发明中，作为在酰基、酰氧基或磺酰氧基、或者X

Boc表示叔丁氧基羰基。另外，这些中，芳基或杂环可以进一步具有含有1～10个碳原子的直链状或支链状的烷基、卤素、氨基、胺、硝基或羟基等取代基。

上述式(X-1)或(X-2)中的2个醚键中的一个可以被切断。

另外，上述式(X-1)或(X-2)中，异喹啉骨架中所含的1个或2个叔N进一步被含有1～10个碳原子的直链状或支链状的烷基或芳基修饰后的季N离子化合物也包括在本发明的双苄基异喹啉生物碱中。作为季N离子化合物，可列举例如下述式(X-3)或(X-4)等所示的化合物。

式(X-3)或式(X-4)中的R

作为式(X-1)～式(X-4)所示的双苄基异喹啉生物碱，可分别列举例如以下的式(I)～式(V)所示的化合物。

式(I)～式(V)中的R

作为式(X-1)～式(X-4)中的1个醚键断裂后的化合物，可列举例如作为式(III)中的1个醚键断裂后的化合物的下述式(VI)所示的化合物。

式(VI)中，R

本发明中的上述式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物包括所有的立体异构体、光学异构体或这些的混合物。可列举例如异喹啉环上的作为季碳的C(1)和C(1’)分别具有选自RR、SS、1S1’R或1R1’S的立体异构构型的化合物。

本发明中的上述式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物可以为水合物。

另外，作为本发明中的上述式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物的药学上可接受的盐，可列举无机盐或有机酸盐等。作为无机盐，没有限定，可列举例如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐、碳酸盐、磷酸盐、氢溴酸盐或氢碘酸盐等。作为有机酸盐，没有限定，可列举例如甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、苹果酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐或α-甘油磷酸盐等。

作为式(I)所示的双苄基异喹啉生物碱及其药学上可接受的盐，具体可列举小檗胺、(+)-小檗胺、小檗胺二盐酸盐、E6-小檗胺(E6-norberbamine)、防己诺林碱(Fangchinoline)、粉防己碱(Tetrandrine)、异粉防己碱(Isotetrandrine)或Cocsoline等。

将小檗胺的结构式示于以下。

将(+)-小檗胺的结构式示于以下。

将E6-小檗胺的结构式示于以下。

将防己诺林碱的结构式示于以下。

将粉防己碱的结构式示于以下。

将异粉防己碱的结构式示于以下。

将Cocsoline的结构式示于以下。

另外，作为式(I)所示的双苄基异喹啉生物碱，具体而言，还可列举以下的结构式所示的作为小檗胺衍生物的BBMD1～BBMD13等。

将BBMD1的结构式示于以下。

将BBMD2的结构式示于以下。

将BBMD3的结构式示于以下。

将BBMD4的结构式示于以下。

将BBMD5的结构式示于以下。

将BBMD6的结构式示于以下。

将BBMD7的结构式示于以下。

将BBMD8的结构式示于以下。

将BBMD9的结构式示于以下。

将BBMD10的结构式示于以下。

将BBMD11的结构式示于以下。

将BBMD12的结构式示于以下。

将BBMD13的结构式示于以下。

作为式(II)所示的双苄基异喹啉生物碱，具体而言，可列举千金藤素、刺檗碱(Oxyacanthine)、皱唐松草宁碱(Thalrugosaminine)或Cocsoline等。

将千金藤素的结构式示于以下。

将刺檗碱的结构式示于以下。

将皱唐松草宁碱的结构式示于以下。

将Cocsoline的结构式记载如下。

作为式(III)所示的双苄基异喹啉生物碱，具体而言，可列举2-去甲小檗胺(2-norberbamine)等。

将2-去甲小檗胺的结构式记载如下。

作为式(IV)所示的双苄基异喹啉生物碱，具体而言，可列举轮环藤碱(Cycleanine)等。

将轮环藤碱的结构式示于以下。

作为式(V)所示的双苄基异喹啉生物碱，具体而言，可列举筒箭毒碱(tubocurarine)、氯化筒箭毒碱五水合物(curare pentahydrate)等。将氯化筒箭毒碱五水合物的结构式示于以下。

作为式(VI)所示的化合物，具体而言，可列举蝙蝠葛碱(Dauricine)、木兰碱(Magnoline)或蝙蝠葛苏林碱(Daurisoline)等。

将蝙蝠葛碱的结构式示于以下。

将木兰碱的结构式示于以下。

将蝙蝠葛苏林碱的结构式示于以下。

另外，本发明还提供：包括在含有Ca

CaMKII是可被Ca

作为CaMKII抑制剂，除了上述式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐以外，还可列举源自存在于其调节域的自磷酸化位点的序列的肽AIP(Autocamtide 2相关抑制肽)、星形孢菌素(Staurosporine)、法舒地尔(Fasudil)、1-萘基PP1、K-252a、KN-62、薰草菌素C(Lavendustin C)、12(S)-HPETE、K-252b、HA-1077二盐酸盐、Arcyriaflavin A等。CaMKII抑制剂既可以是单独的化合物，也可以为植物提取物之类的组合物或混合物。另外，CaMKII抑制剂可以是人工合成的，也可以是天然产物来源。

另外，靶向CaMKII基因家族的siRNA等抑制CaMKII基因家族的方法也包括在本发明的CaMKII抑制剂中。抑制CaMKII基因家族的方法可以通过基因打靶或基因组编辑等来改变干细胞、T细胞或NK细胞的基因组DNA，也可以导入例如shRNA等而永久地下调基因表达水平。基因打靶可列举例如向公知的多能干细胞中导入靶向载体而引发同源重组的方法等。作为基因编辑，没有特别限制，可列举例如公知的锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription Activator-like Effector Nuclease，TALEN)或CRISPR/Cas9等。

[T细胞]

本发明中的T细胞是指在表面表达被称为T细胞受体(T cell receptor、TCR)的抗原受体的细胞。

作为本发明中的T细胞，没有特别限制，优选表达CD3且表达CD4和CD8中的至少一种分子的T细胞。

作为这样的T细胞，可列举例如辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞、初始T细胞、干细胞样记忆性T细胞(TSCM)、中央记忆性T细胞(TCM)、效应记忆性T细胞或终末效应T细胞等。

辅助性T细胞为CD4阳性细胞，还可根据所表达的细胞因子而分为Th1细胞、Th2细胞和Th17细胞等(例如，J Allergy Clin.Immunol.,135(3):626-635,2012)。

作为Th1细胞，可列举例如表达IFN-γ、IL-2或TNF-α等的细胞等。作为Th2细胞，可列举例如表达IL-4、IL-5、IL-6、IL-10或IL-13等的细胞等。作为Th17细胞，可列举例如表达IL-17或IL-6等的细胞等。

细胞毒性T细胞为CD8阳性细胞，与辅助性T细胞同样地，可根据所表达的细胞因子而分为Tc1细胞和Tc2细胞等。

作为Tc1细胞，可列举例如表达IFN-γ、IL-2或TNF-α等的细胞等。作为Tc2细胞，可列举例如表达IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等的细胞等。

作为调节性T细胞，可优选列举例如CD4(+)CD25(+)FoxP3(+)细胞。

作为初始T细胞，可优选列举例如CD4(+)CD45RA(+)CD62L(+)CCR7(+)细胞、CD8(+)CD45RA(+)CD62L(+)CCR7(+)细胞、CD4(+)CCR7(+)CD45RA(+)CD95(-)CD45RO(-)细胞或CD8(+)CCR7(+)CD45RA(+)CD95(-)CD45RO(-)细胞等。

作为干细胞样记忆性T细胞，可优选列举例如CD4(+)CD45RA(+)CD62L(+)CCR7(+)CD95(+)细胞、CD8(+)CD45RA(+)CD62L(+)CCR7(+)CD95(+)细胞、CD4(+)CCR7(+)CD45RA(+)CD95(+)CD45RO(+)细胞或CD8(+)CCR7(+)CD45RA(+)CD95(+)CD45RO(+)细胞等。

作为中央记忆性T细胞，可优选列举例如CD4(+)CD45RA(-)CD62L(+)CCR7(+)CD95(+)细胞、CD8(+)CD45RA(-)CD62L(+)CCR7(+)CD95(+)细胞、CD4(+)CCR7(+)CD45RA(-)CD45RO(+)细胞或CD8(+)CCR7(+)CD45RA(-)CD45RO(+)细胞等。

作为效应记忆性T细胞，可优选列举例如CD4(+)CCR7(-)CD45RA(-)CD45RO(+)细胞或CD8(+)CCR7(-)CD45RA(-)CD45RO(+)细胞等。

作为终末效应T细胞，可优选列举例如CD4(+)CD45RA(+)CD62L(-)细胞或CD8(+)CD45RA(+)CD62L(-)细胞等。

本发明中的T细胞优选未分化T细胞。作为未分化T细胞，例如按照未分化度从高到低的顺序可列举初始T细胞、干细胞样记忆性T细胞和中央记忆性T细胞。这些中，从维持细胞的未分化状态、提高增殖性和生物体持续性的角度出发，特别优选初始T细胞和干细胞样记忆性T细胞。

由于未分化性高的T细胞显示出高的治疗效果，因此本发明中的T细胞优选用于免疫细胞疗法的T细胞。

作为判断T细胞是否维持了未分化状态的方法，可列举：通过检测到未分化标志物的表达和/或检测不到分化标志物的表达来进行判定的方法、通过检测其它的各种标志物(基因、蛋白质)的表达来进行判定的方法、或观察细胞的形态学特征的方法等。例如，CCR7可作为外周血的未分化标志物使用(例如，Nature Reviews Immunology,18:363-373,2018)。

本发明中的T细胞优选源自多能干细胞的T细胞。

由多能干细胞诱导T细胞的方法可以使用公知的方法来进行。具体而言，例如，作为CD8阳性细胞的制造方法，可列举国际公开第2016/076415号中记载的方法，作为CD4CD8双阳性T细胞的制造方法，可列举国际公开第2017/221975号中记载的方法。

本发明中，多能干细胞是指具有能够分化成存在于生物体内的多种细胞的多能性并且还同时具有增殖能力的干细胞，至少包括可诱导为本发明所使用的造血祖细胞的任意细胞。

多能干细胞优选源自哺乳动物，更优选源自人。

多能干细胞没有特别限定，包括例如胚胎干(ES)细胞、通过核移植而得到的克隆胚胎来源的胚胎干(ntES)细胞、精子干细胞(GS细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、诱导性多能干(iPS)细胞、培养成纤维细胞或脐带血来源的多能干细胞、或骨髄干细胞来源的多能干细胞(Muse细胞)等。本发明中，从制造步骤中能够在不破坏胚胎、卵子等的情况下获得的观点出发，优选的多能干细胞为iPS细胞，更优选人iPS细胞。

iPS细胞的制造方法在本领域中是公知的，可通过向任意的体细胞中导入重编程因子来制造。作为重编程因子，可列举例如Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3或Glis1等基因或基因产物。这些重编程因子可以单独使用，也可以组合使用。

作为重编程因子的组合，可列举国际公开第2007/069666号、国际公开第2008/118820号、国际公开第2009/007852号、国际公开第2009/032194号、国际公开第2009/058413号、国际公开第2009/057831号、国际公开第2009/075119号、国际公开第2009/079007号、国际公开第2009/091659号、国际公开第2009/101084号、国际公开第2009/101407号、国际公开第2009/102983号、国际公开第2009/114949号、国际公开第2009/117439号、国际公开第2009/126250号、国际公开第2009/126251号、国际公开第2009/126655号、国际公开第2009/157593号、国际公开第2010/009015号、国际公开第2010/033906号、国际公开第2010/033920号、国际公开第2010/042800号、国际公开第2010/050626号、国际公开第2010/056831号、国际公开第2010/068955号、国际公开第2010/098419号、国际公开第2010/102267号、国际公开第2010/111409号、国际公开第2010/111422号、国际公开第2010/115050号、国际公开第2010/124290号、国际公开第2010/147395号、国际公开第2010/147612号、Huangfu D,et al.,Nat.Biotechnol.,26:795-797,2008、Shi Y,et al.,Cell Stem Cell,2:525-528,2008、Eminli S,et al.,StemCells.26:2467-2474,2008、Huangfu D,et al.,Nat.Biotechnol.26:1269-1275,2008、ShiY,et al.,Cell Stem Cell,3,568-574,2008、Zhao Y,et al.,Cell Stem Cell,3:475-479,2008、Marson A,,Cell Stem Cell,3,132-135,2008、Feng B,et al.,Nat.CellBiol.11:197-203,2009、R.L.Judson et al.,Nat.Biotechnol.,27:459-461,2009、Lyssiotis CA,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.106:8912-8917,2009、Kim JB,etal.,Nature.461:649-643,2009、Ichida JK,et al.,Cell Stem Cell.5:491-503,2009、Heng JC,et al.,Cell Stem Cell.6:167-74,2010、Han J,et al.,Nature.463:1096-100,2010、Mali P,et al.,Stem Cells.28:713-720,2010或Maekawa M,et al.,Nature.474:225-9,2011等中记载的组合等。

作为制造iPS细胞时使用的体细胞，没有特别限制，可列举例如胎儿(仔)的体细胞、新生儿(仔)的体细胞、成熟的健康的或疾病性的体细胞、原代培养细胞、传代细胞或确立细胞株等。

作为上述体细胞，可列举例如(1)神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞或牙髓干细胞等组织干细胞(例如体干细胞)；(2)造血祖细胞等组织祖细胞；或(3)血液细胞(例如外周血细胞或脐带血细胞等)；骨髓细胞、淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞、成纤维细胞(例如皮肤细胞等)、毛样细胞、肝细胞、胃粘膜细胞、肠细胞、脾细胞、胰腺细胞(例如胰腺外分泌细胞等)、脑细胞、肺细胞、肾细胞或脂肪细胞等已分化细胞等。作为上述体细胞，优选T细胞，但是也可以使用T细胞以外的体细胞(非T细胞)。

作为体细胞，优选例如进行了TCR的基因重排的淋巴细胞(优选T细胞)。在使用淋巴细胞作为体细胞时，优选在重编程步骤之前在IL-2等细胞因子存在下利用抗CD3抗体和抗CD28抗体对该淋巴细胞进行刺激而使其活化。

上述刺激例如可如下进行：向培养基中添加IL-2等细胞因子、抗CD3抗体或抗CD28抗体，将上述淋巴细胞培养一定时间，由此而进行。另外，抗CD3抗体和抗CD28抗体可以为结合于磁珠等者，另外，作为向培养基中添加这些抗体的替代方式，还可以通过在表面结合有抗CD3抗体和抗CD28抗体的培养皿上将上述T细胞培养一定时间来给予刺激。另外，还可以通过向培养基中添加识别人T细胞的抗原肽来给予刺激。

本发明中，成为体细胞收集源的哺乳动物个体没有特别限制，但优选人。在将所生产的T细胞用于输血时，从使接受输血的患者与人白细胞型抗原(HLA)容易配型的观点出发，成为iPS细胞的起源的体细胞优选从接受输血的对象分离。

作为iPS细胞，可以使用已有的细胞株。例如，作为人iPS细胞株，可列举253G1株(理研细胞库No.HPS0002)、201B7株(理研细胞库No.HPS0063)、409B2株(理研细胞库No.HPS0076)、454E2株(理研细胞库No.HPS0077)、HiPS-RIKEN-1A株(理研细胞库No.HPS0003)、HiPS-RIKEN-2A株(理研细胞库No.HPS0009)、HiPS-RIKEN-12A株(理研细胞库No.HPS0029)、或Nips-B2株(理研细胞库No.HPS0223)等。

iPS细胞还可以为预先导入了CAR或特异性TCR的iPS细胞。

在此，CAR是指：包含与抗原结合的细胞外结构域和源自不同于上述细胞外结构域的多肽的细胞内结构域的融合蛋白。作为CAR，可列举例如：使将针对特定抗原的、抗体中的抗原识别部位(可变区的L链和H链)与例如CD3等T细胞受体的细胞内结构域和CD28或4-1BB等共刺激分子的细胞内结构域结合而得到的融合蛋白等(例如日本特表2015-509716号公报)。

CAR的抗原识别部位可根据作为目标的抗原来选择，由此能够制作针对目标抗原的特异性T细胞。例如，在以CD19为抗原时，通过克隆抗CD19抗体的抗原识别部位并使其与CD3分子的细胞内结构域结合来形成CAR(例如，Cancer Res.,66:10995-11004,2006)。另外，通过对进行结合的共刺激分子的种类、数量进行选择，能够对活化的强度或持续时间进行控制(例如，Mol Ther.,17:1453-1464,2009)。

通过导入CAR，由源自T细胞的iPS细胞或并非源自T细胞的iPS细胞分化诱导得到的T细胞均能够被赋予针对目标抗原的特异性。另外，通过导入CAR，能够直接识别抗原分子，即使对于HLA I类基因的表达下降的肿瘤也能够引起强烈的免疫反应。

另外，通过导入特异性TCR，由源自T细胞的iPS细胞或并非源自T细胞的iPS细胞分化诱导得到的T细胞均能够被赋予针对目标细胞的特异性。另外，即使对于癌特异性表达肽-HLA复合物的肿瘤也能够引起强烈的免疫反应。

本发明中的T细胞没有特别限制，可以为外周血来源的T细胞。另外，上述的导入CAR、TCR的T细胞可以为外周血中的T细胞。外周血的来源为患者自身、血亲供体、非血亲供体等健康人来源。

另外，本发明中的T细胞可以为原代造血干/祖细胞来源的T细胞。原代造血干/祖细胞可由脐带血或骨髓或经动员的外周血等采集，这些来源为患者自身或血亲供体或非血亲供体等健康人来源。由原代造血干/祖细胞诱导T细胞的方法可以通过与上述的由多能干细胞诱导T细胞的方法相同或类似的方法来进行(例如Induction of T-cell developmentfrom human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1in vitro；Blood,105(4):1431-1439,2005)。

本发明中的T细胞优选具有期望的抗原特异性。因此，上述的成为iPS细胞的起源的淋巴细胞优选具有期望的抗原特异性。

该淋巴细胞可以使用固定有期望的抗原的亲和柱等通过纯化而特异性分离。该纯化中还可以采用下述方法：使用结合有期望的抗原的使主要组织相容性复合物(MHC)四聚体化而成的物质(所谓的MHC四聚体)，从人的组织中纯化具有期望的抗原特异性的淋巴细胞。

另外，即使不特意进行纯化，也可以通过利用CD3抗体、CD3珠的刺激来选择性地增殖T细胞，由此浓缩得到T细胞。

[NK细胞]

关于本发明中的NK细胞，任何NK细胞均可利用。需要说明的是，NK细胞的提供者(供体)和NK细胞的被提供者(接受者)优选为同种。例如，在提供者为人的情况下，被提供者为人。另外，NK细胞的提供者和NK细胞的被提供者更优选为同一个体。例如，在供体为提供者X的情况下，接受者为提供者X。

本发明中的NK细胞可以通过公知的方法(例如日本专利第5016732号公报中记载的方法)获得。NK细胞可以由从外周血、淋巴结、胸腺、骨髓、肿瘤、胸水、腹水或脐带血采集的单核细胞、更优选外周血单核细胞诱导而获得。例如，可以通过密度离心法从外周血中回收包含NK细胞的单核细胞。

本发明中的NK细胞优选为多能干细胞来源的NK细胞。多能干细胞优选为哺乳动物来源，更优选为人来源。由多能干细胞诱导NK细胞的方法可以使用公知的方法(例如CellStem Cell.23(2):181-192,2018中记载的方法)来进行。关于多能干细胞，与上述相同。

本发明中的NK细胞可以为原代造血干/祖细胞来源的NK细胞。关于原代造血干/祖细胞，与上述相同。

本发明中的NK细胞可以为外周血来源的NK细胞。外周血的来源为患者自身、血亲供体、非血亲供体等健康人来源。另外，由于NK细胞显示出高的治疗效果，因此本发明中的NK细胞优选为用于免疫细胞疗法的NK细胞。

作为NK细胞，可列举例如CD3(-)CD56(+)细胞。进而，作为NK细胞，可列举除了表达CD3(-)CD56(+)以外还表达CD2(+/-)、CD5(-)、CD7(+)、CD8(+)、CD1d(-)、CD16a(+)、CD27(+)、CD49a～f(+)CD56(+)、CD57(+)、CD94(+)、CD161(+)或CD165(+)等表面标志物的细胞。

本发明中的NK细胞可以为未成熟NK细胞或成熟NK细胞中的任一者，可列举例如CD56 bright CD16(-)未成熟NK细胞或CD56 dim CD16(+)成熟NK细胞等。

[用于培养T细胞或NK细胞的培养基]

本发明的用于培养T细胞或NK细胞的培养基含有式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐。

本发明的用于培养T细胞或NK细胞的培养基可以以动物细胞培养中所使用的培养基为基础培养基、并且添加式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐而制备。

关于本发明的用于培养T细胞或NK细胞的培养基中的式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐的含量，只要显示出对T细胞或NK细胞的增殖促进活性就没有特别限定，例如通常为0.1nM～10μM，作为优选的范围，可列举0.1nM～3μM、0.1nM～10nM、1nM～3μM、1nM～10nM、10nM～100nM、100nM～1μM或1nM～1μM等。在式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱及其药学上可接受的盐为选自小檗胺、(+)-小檗胺、小檗胺二盐酸盐、E6-小檗胺和千金藤素中的至少1种时，优选为0.1nM～10μM。

作为基础培养基，可列举例如伊思柯夫改良杜尔贝科(Iscove’sModifiedDulbecco’s Medium，IMDM)培养基、Medium 199培养基、最低限量伊格尔(Eagle’s MinimumEssential Medium，EMEM)培养基、αMEM培养基、杜尔贝科改良伊格尔(Dulbecco’sModified Eagle’sMedium，DMEM)培养基、Ham’s F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基、Neurobasal培养基(Life Technologies Japan Ltd.)和它们的混合培养基等。培养基中可以含有血清，或者也可以不使用血清。

根据需要，基础培养基还可以含有例如白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫代甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类或细胞因子等中的1种以上物质。

本发明的用于培养T细胞或NK细胞的培养基优选还含有维生素C类或细胞因子。

维生素C类是指L-抗坏血酸及其衍生物，L-抗坏血酸衍生物是指在生物体内通过酶反应而成为维生素C的物质。作为L-抗坏血酸的衍生物，可列举例如维生素C磷酸酯、抗坏血酸葡糖苷、维生素C乙基醚、维生素C酯、四己基癸酸抗坏血酸酯、硬脂酸抗坏血酸酯或抗坏血酸-2磷酸-6棕榈酸等。优选维生素C磷酸酯，可列举例如磷酸-L-抗坏血酸酯Na或磷酸-L-抗坏血酸酯Mg等磷酸-L-抗坏血酸酯盐。维生素C类在用于培养T细胞或NK细胞的培养基中的浓度为例如5μg/ml～500μg/ml。

作为细胞因子，可列举例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21或Flt3L等。关于它们在用于培养T细胞或NK细胞的培养基中的浓度，例如，IL-7为1ng/ml～100ng/ml，IL-12为1ng/ml～100ng/ml，IL-15为1ng/ml～100ng/ml，IL-18为1ng/ml～100ng/ml，IL-21为1ng/ml～100ng/ml，Flt3L为1ng/ml～100ng/ml。

本发明的用于培养T细胞或NK细胞的培养基通过含有式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐而能够维持该细胞的状态(例如未分化性)并且促进细胞增殖，因此可以不含饲养细胞。通过使培养基中不含饲养细胞，能够降低来源于饲养细胞的感染风险，而且制造的稳定性提高，其结果是能够降低成本。

本发明的用于培养T细胞或NK细胞的培养基除了含有式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐以外还可以含有MAPK级联抑制剂。通过组合使用MAPK级联抑制剂，能够增强在免疫细胞疗法中活性优良的细胞(例如记忆性T细胞)的增殖。

MAPK级联由MAPKKK、MAPKK和MAPK这3种激酶(蛋白激酶)分子等构成，在人细胞中至少存在3种(ERK级联、p38级联、JNK级联)功能不同的MAPK级联(例如，电泳、60：7～10页、2015年)。其中，ERK途径可被生长因子等活化，主要作用于细胞增殖，与此相对地，作为应激应答MAPK级联的p38级联和JNK级联可被各种各样的环境压力刺激、炎症性细胞因子活化，在细胞凋亡诱导、免疫应答的控制中发挥重要的作用。

作为本发明中的MAPK级联抑制剂，可优选列举ERK级联抑制剂或p38级联抑制剂。作为ERK级联抑制剂，可列举例如构成ERK级联的BRAF、靶向RAF等的抑制剂(例如CEP-32496或ZM-336372等)等。作为p38级联抑制剂，可列举例如靶向p38的抑制剂(例如SB-203580或洛批莫德(Losmapimod)等)等。

[T细胞或NK细胞的培养]

作为T细胞或NK细胞的培养中使用的培养容器，没有特别限定，可列举例如烧瓶、培养皿、培养盘、微孔板、微型载玻片、腔室载玻片、管、托盘或培养袋等。作为这些培养容器的基材，没有特别限定，可列举例如玻璃或聚丙烯或聚苯乙烯等各种塑料等。

培养容器可以是细胞粘附性的，也可以是细胞非粘附性的，可根据目的适宜地选择。细胞粘附性的培养容器可以出于提高培养容器的表面与细胞的粘附性的目的用胞外基质(ECM)等任意的细胞支撑用基质进行了涂覆。

作为细胞支撑用基质，可列举例如胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白或层粘连蛋白的部分结构体、纤连蛋白或它们的混合物等，具体而言，可列举基质胶或溶解细胞膜制备物等(例如，Lancet,365,9471,1636-1641,2005)。

培养中使用的T细胞或NK细胞可以是分散细胞或非分散细胞。分散细胞是指为了促进细胞分散而进行了处理的细胞。作为分散细胞，可列举例如形成了包含2～50个、2～20个、或2～10个细胞的小细胞块的细胞。分散细胞可以是浮游(悬浮)细胞或粘附细胞。

T细胞或NK细胞的培养密度只要为可实现促进细胞的存活和增殖的效果那样的密度就没有特别限定。优选为1.0×10

温度、CO

在T细胞或NK细胞的培养中，可以在饲养细胞存在下进行培养，但优选在不使用饲养细胞的情况下进行培养。培养T细胞或NK细胞时的温度条件没有特别限定，例如，通常为37～42℃，优选为37～39℃。另外，关于培养时间，本领域技术人员可一边监控T细胞或NK细胞的数量等一边适宜地决定。天数没有特别限定，例如，至少为1天以上、2天以上、3天以上、4天以上、5天以上、10天以上、30天以上、40天以上、50天以上、60天以上、70天以上，优选为3天以上，更优选为10天以上，进一步优选为30天以上，特别优选为40天以上，最优选为50天以上。根据本发明的培养方法，能够实现50天以上的长期培养。

本发明的T细胞或NK细胞的制造方法可根据需要包括对T细胞或NK细胞进行传代的步骤。T细胞的传代和分化诱导可以通过现有公知的方法来进行。

通过本发明的T细胞或NK细胞的制造方法得到的包含T细胞或NK细胞的细胞组合物可用作用于再生医疗的细胞源等。上述细胞组合物可以是小的细胞块这样的、分散后的包含T细胞或NK细胞的组合物。

上述细胞组合物可以用于例如通过冷冻保存而进行的T细胞或NK细胞的保存、运输和传代中。上述细胞组合物可以还包含血清或其替代物、或DMSO等有机溶剂。这种情况下，血清或其替代物的浓度没有特别限定，例如为1～50％(v/v)，优选为5～20％(v/v)。有机溶剂的浓度没有特别限定，例如为0～50％(v/v)，优选为5～20％(v/v)。上述细胞组合物可以包含饲养细胞，但优选不含饲养细胞。

[免疫细胞疗法剂]

通过本发明的制造方法得到的T细胞、NK细胞或其细胞组合物可以优选用作免疫细胞疗法剂。T细胞、NK细胞或其细胞组合物可按照公知的方法与药学上可接受的载体混合等而以经口/非经口制剂、优选注射剂、悬浮剂或点滴剂等非经口制剂形式来制造。作为该非经口制剂中可包含的药学上可接受的载体，可列举例如生理盐水、包含葡萄糖或其它辅助药的等渗液(例如D-山梨醇、D-甘露醇或氯化钠等)等注射用水性液。

免疫细胞疗法剂可以与例如缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液或乙酸钠缓冲液等)、无痛化剂(例如苯扎氯铵或盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如人血清白蛋白或聚乙二醇等)、保存剂或抗氧化剂等进行配合。

在将免疫细胞疗法剂制剂化为水性悬浮液剂时，在上述缓冲液中以例如约1.0×10

如此而得到的制剂稳定且为低毒性，因此能够对人等哺乳动物安全地给药。给药方法没有特别限定，可以以经口或非经口方式进行给药，优选为注射或点滴给药，作为给药途径，可列举例如静脉内给药、皮下给药、皮内给药、肌肉内给药、腹腔内给药或患部直接给药等。该免疫细胞疗法剂的给药量根据给药对象、对象器官、症状或给药方法等而存在差异，通常对于成人患者(设为体重60kg)而言，可列举例如在非经口给药的情况下每1次将以细胞数计为约1.0×10

为了促进所给药的T细胞或NK细胞在生物体内的活化，在本发明的免疫细胞疗法剂中可以将作为其有效成分的T细胞或NK细胞与T细胞或NK细胞的受体配体组合。

[维持未分化状态的方法]

本发明的维持未分化T细胞的未分化状态的方法的特征在于，在上述的用于培养T细胞的培养基中培养T细胞。关于T细胞的培养方法，与上述相同。通过在该培养基中培养未分化T细胞，能够利用式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐的作用来维持未分化T细胞的未分化状态。

T细胞的未分化状态的维持例如可通过下述方式来评价：与在不存在式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐的条件下培养的T细胞相比，在式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐存在下培养的T细胞中，T细胞的未分化标志物基因的表达水平在mRNA水平或蛋白质水平方面是否能显著地维持在与开始培养时的表达水平同等程度的水平。作为T细胞的未分化标志物基因，可列举例如CCR7基因等。

作为测定未分化标志物基因的表达水平的方法，就mRNA水平而言，可列举例如使用标志物基因特异性底物或探针的RT-PCR、定量PCR或RNA印迹等方法。另外，就蛋白质水平而言，可列举例如使用由标志物基因编码的蛋白质特异性抗体的ELISA、流式细胞术或蛋白质印迹等免疫学方法。

关于测定未分化标志物基因的表达水平的结果，当开始培养时的T细胞中的未分化标志物基因的表达水平与在式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐存在下培养规定时间后的T细胞中的未分化标志物基因的表达水平的相对比值大于在不存在式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐的条件下培养时的该相对比值(对照)时，可以判定为能够维持T细胞的未分化状态。

[T细胞或NK细胞的增殖促进剂]

本发明的T细胞或NK细胞的增殖促进剂(以下也简称为本发明的增殖促进剂)的特征在于，包含式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐。通过使用包含本发明的增殖促进剂的培养基培养T细胞或NK细胞，即使在不使用饲养细胞的情况下也能够显著提高T细胞或NK细胞的增殖效率并且维持该细胞的状态(例如未分化性)。

本发明的增殖促进剂还可以以进一步包含生理学上可接受的载体〔例如生理性等渗液[生理盐水、上述基础培养基、包含葡萄糖或其它辅助药(例如D-山梨醇、D-甘露醇或氯化钠等)的等渗液等]、赋形剂、防腐剂、稳定剂(例如人血清白蛋白或聚乙二醇等)、结合剂、助溶剂、非离子型表面活性剂、缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液或乙酸钠缓冲液等)、保存剂、抗氧化剂或上述添加物等〕、信号转导抑制剂等的组合物的形式来提供。

关于本发明的增殖促进剂中所含的式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱或者其中的1个醚键断裂后的化合物或其药学上可接受的盐的含量，例如，在将本发明的增殖促进剂添加于培养基时，该培养基中的该化合物的浓度优选为包含足以促进T细胞或NK细胞的增殖的浓度。

本发明的增殖促进剂优选通过以等渗的水溶液或粉末等状态添加于培养基等方法来使用。

T细胞或NK细胞的增殖促进例如可以通过下述方式来评价：与在不存在本发明的增殖促进剂的条件下培养的T细胞或NK细胞相比，在本发明的增殖促进剂存在下培养的该T细胞或NK细胞的细胞数是否显著增加。细胞数的测定例如可以通过公知的MTT法或WST法等使用市售的细胞数测定试剂盒来进行。关于测定的结果，当开始培养时的T细胞或NK细胞的细胞数与在本发明的增殖促进剂存在下培养规定时间后的T细胞或NK细胞的细胞数的相对比值大于在不存在本发明的增殖促进剂的条件下培养时的该相对比值(对照)时，可以判定为能够促进T细胞或NK细胞的增殖。

以下示出实施例来具体地说明本发明，但是本发明不受这些实施例限定。

实施例

[实施例1]iPS细胞的分化诱导

由iPS细胞向T细胞的诱导通过改变非专利文献1中记载的方法来进行。将实施例1中对iPS细胞进行分化诱导的步骤的示意图示于图1。

以小鼠胎仔成纤维细胞(MEF)作为饲养细胞而维持iPS细胞。培养基使用iPS细胞用培养基[杜尔贝科改良伊格尔培养基/Nutrient Mixture F-12Ham(Sigma)、Knokout血清替代物(KSR、20％、Life Technologies)、1×胰岛素、转铁蛋白、硒溶液(ITS-G、100×、Thermo Fisher Scientific)、1％MEM非必需氨基酸溶液(NEAA、Life Technologies)、0.1mM 2-巯基乙醇(55mM、Gibco)、成纤维细胞生长因子(Sigma)]。

造血祖细胞(HPCs)通过在10T1/2细胞上培养iPS细胞来诱导形成Sac而得到(非专利文献2)。10T1/2细胞使用加入了1％FBS、1％L谷氨酰胺-青霉素-链霉素溶液(PSG、Sigma)的伊格尔基础培养基(Life Technologies)在包被有0.1％明胶的培养皿中维持，作为饲养细胞使用。

将iPS细胞用剥离剂[添加了CaCl

T细胞通过将HPC与OP9-DL1细胞进行共培养而诱导。OP9-DL1细胞用添加了15％FBS和1％PSG的alpha-MEM培养基(Life technologies)进行维持。用移液管的前端回收开始分化诱导后第14天的Sac，移液后使其通过细胞过滤网，回收透过液。

将得到的血液细胞接种于OP9-DL1细胞，用添加了IL-7(1ng/mL)、Flt3L(10ng/mL)、PAA(50μg/mL)、ITS-G、15％FBS和1％PSG的alpha-MEM培养基(Life technologies)进行培养。

3天后，将血液细胞转移到新鲜的OP9-DL1细胞上。以后每3天进行培养基交换，并且每6天转移到新鲜的OP9-DL1细胞上。在与OP9-DL1细胞开始共培养起24天后，交换为添加了IL-7(10ng/mL)、Flt3L(10ng/mL)、PAA(50μg/mL)、ITS-G、15％FBS、PSG和Anti-CD3抗体OKT3(1μg/mL)的alpha-MEM培养基。

3天后，通过胰酶处理和粘附筛选而除去OP9-DL1细胞后，转移到包被有RetroNectin(注册商标)(TaKaRa、用PBS稀释成2μg/mL)的24孔板，用添加了IL-7(10ng/mL)、Flt3L(10ng/mL)、IL-21(10ng/mL)、PAA(50μg/mL)、ITS-G、15％FBS和PSG的alpha-MEM培养基进行培养。

在OKT3刺激起的6天后，将细胞用CD8beta-PE(Beckman)、CD5-PECy7(ThermoFischer)、CD1a-FITC(ThermoFisher)和CD336-APC(Bi olegend)染色，对CD8beta(+)CD5(+)CD1a(-)CD336(-)细胞进行分选，得到CD8(+)T细胞(T-iPS-T细胞)。

[实施例2]iPS-T细胞的扩大培养

按照实施例1的方法得到的CD8(+)T细胞(T-iPS-T细胞)仅有数千至数万个细胞。将该细胞与植物凝集素-P(PHA)和健康人供体来源PBMC进行共培养而增加到数万倍。将实施例2中对iPS-T细胞进行增殖(Expansion)的步骤的示意图示于图2。

将PBMC解冻，用添加了15％FBS和PSG的alpha-MEM培养基培养一晚。次日对该PBMC进行辐射线照射后(40Gy)，在添加了IL-7(5ng/mL)、IL-15(5ng/mL)、泛Caspase抑制剂Z-VAD-FMK(R&DSystems、10μM)、PAA(50μg/mL)、ITS-G、15％FBS和PSG的alpha-MEM培养基中与iPS-T细胞混合，添加PHA(Wako、2μg/mL)(第0天)。每3天进行培养基交换，根据增殖而适宜地传代，培养到第14天。在本实施例中，根据需要实施1次或2次该步骤。

[实施例3]免疫表型检查

通过流式细胞术分析了iPS-T细胞中的T细胞相关分子的表达。分析时，使用将CD8ab(+)iPS-T细胞用PHA和PBMC进行了0～2次增殖(expand)的细胞。染色时，使用CD8β-PE(BECKMAN)、CD5-PECy7(ThermoFisher)、CD27-APC、CD28-BV421、CCR7-APC、CD45RA-BV510、CD45RO-APCCy7和CD62L-FITC、CD95-PECy7(以上为BioLegend制造)。分析时使用BDLSRFORTESSA cytometer(BD Bioscience)，用碘化丙啶(PI)排除死细胞。

将使用进行了一次增殖的T-iPS-T细胞的免疫表型检查的步骤的示意图示于图3A，将其结果示于图3。如图3B所示，CD95和CD45RA为100％阳性。另外，确认到CD5、CD27、CCR7、CD45RO的部分表达。CD28和CD62L在作为阳性对照的健康人来源PBMC中的T细胞中确认到表达，在T-iPS-T细胞中未确认到表达。

接着，为了评价与T细胞的增殖相伴随的、标志物分子的表达在分化过程中的变化，对实施例2中的增殖次数不同的T-iPS-T细胞进行了比较研究。将关于研究步骤的示意图示于图4(A)，将其结果示于图4(B)。如图4(B)所示，确认到CCR7的表达水平和CCR7阳性细胞率随着增殖而下降。

已知PBMC中的T细胞存在以CD45RA(+)CCR7(+)初始T细胞为未分化性顶峰的阶段性(例如Nicholas P.Restifo,Blood,124:476-477,2014)。由此表明，CD45RA(+)CCR7(+)可作为iPS-T细胞中的未分化细胞标志物。

[实施例4]以活细胞数为指标的低分子化合物的筛选

在不使用PBMC饲养细胞的情况下培养T-iPS-T细胞，对改善增殖效率的低分子化合物进行筛选。将筛选的方案示于图5(A)～(C)。

接种第一次增殖后的T-iPS-T细胞(1500个细胞/孔)，用添加了15％FBS(CORNING、35-076-CV、35076104R)、1％PSG(SIGMA、G1146)、PAA(50μg/mL、Nacalai Tesque、03420-52)、ITS-G、IL-7(5ng/mL)、IL-12(50ng/mL)、IL-15(5ng/mL)、IL-18(50ng/mL)、IL-21(20ng/mL)和z-VAD-fmk(10μM)的RPMI-1640培养基(SIGMA、R8758)进行培养。加入CD3/CD28Dynabeads(gibco、11131D、Dynabeads为注册商标)(4500个珠/孔)进行刺激，将1080种化合物[MedChemExpress、Apoptosis Compound Library(HY-L003)、Cell Cycle/DNA DamageCompound Library(HY-L004)、JAK/STAT Compound Library(HY-L008)、MAPK CompoundLibrary(HY-L010)、NF-kappaB Compound Library(HY-L014)、PI3K/Akt/mTOR CompoundLibrary(HY-L015)、Wnt/Hedgehog/Notch Compound Library(HY-L020)]以终浓度1μM的方式向各孔中各添加1种，在37℃下在5％CO

以作为化合物的溶剂的DMSO(0.1％)为对照。6天后，示于活细胞数测定试剂SF(Nacalai Tesque、07553)和酶标仪(SoftMaxPro 5.X、Molecular Devices、450nm/650nm)测定活细胞数。其结果是，筛选出与DMSO显示同等或更高的吸光度的266种化合物。

如下所述地设定细胞数的标准曲线。在测定活细胞数时，对与筛选时相同的细胞进行12级阶梯稀释，用添加了15％FBS、1％PSG、PAA、ITS-G、IL-7(5ng/mL)和IL-15(5ng/mL)的RPMI-1640培养基进行接种(0～1536000个细胞/孔)。与筛选样品一起测定活细胞数，制作WST-8检测的标准曲线。

对于活细胞数，将对照(DMSO)和排在前20位的化合物的结果示于图6。如图6所示，本实施例中使用的1080种化合物中，在小檗胺(HY-N0714A、Med Chem Express)存在下进行培养时显示出最高的活细胞数。该结果表明，式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱具有在无饲养细胞培养条件下显著促进细胞增殖的作用。

[实施例5]

以CCR7阳性细胞数为指标的低分子化合物的筛选

使用T-iPS-T细胞和从实施例4中使用的1080种化合物中抽取的266种化合物，按照实施例4的培养方法培养6天，通过FACS分析CCR7和CD45RA的表达。将与化合物进行了培养的细胞转移到96孔板，用染色液(包含2％FBS的PBS)清洗后，用CCR7-APC(Biolegend、353214)和CD45RA-BV510(Biolegend、304142)进行染色。

清洗后，用包含PI的染色液进行重悬。使用搭载有HTS的BD LSRFortessacytometer(BD Bioscience)对一半量进行分析，记录所有的细胞。对于用FlowJo10进行分析的PI阴性细胞群中的CD45RA(+)CCR7(+)细胞的数量(#Cells)，将对对照(DMSO)和排在前20位的化合物作图而成的图示于图7。

如图7所示，在本实施例所使用的266种化合物中，小檗胺显示出最高的CD45RA(+)CCR7(+)细胞数。根据以上结果，抽取式(I)的双苄基异喹啉生物碱作为在无饲养细胞培养条件下维持未分化T细胞的未分化性且促进细胞增殖的化合物。

[实施例6]双苄基异喹啉生物碱的浓度依赖性评价

研究了T-iPS-T细胞的无饲养细胞增殖对式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱的浓度依赖性。将T-iPS-T细胞用添加了15％FBS、1％PSG、PAA(50μg/mL)、ITS-G、IL-7(5ng/mL)、IL-12(50ng/mL)、IL-15(5ng/mL)、IL-18(50ng/mL)、IL-21(20ng/mL)和z-VAD-fmk(10μM)的alpha-MEM培养基进行培养。另外，向培养基中以1nM、3nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1μM、3μM或10μM的浓度添加式(I)或式(II)所示的各种双苄基异喹啉生物碱[小檗胺(SIGMA、547190)、(+)-小檗胺(Ark Pharm、AK167975)、E6-小檗胺(Santa Cruz、SC-221573)或千金藤素(Cayman、19648)]。培养6天后，与实施例5的方法同样地进行染色和测定。将结果示于图8和图9。

如图8所示，活细胞数依赖于式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱的浓度而增加，在1μM时可见最大的增殖作用。另外，如图9所示，未分化细胞数依赖于式(I)的双苄基异喹啉生物碱的浓度而增加，在1μM时可见最大的增殖作用。因此，此后的研究均将式(X-1)或式(X-2)所示的双苄基异喹啉生物碱在培养基中的浓度设为1μM而实施。

[实施例7]与PBMC饲养细胞的比较

利用使用T-iPS-T细胞且使用PBMC饲养细胞的与实施例2同样的刺激方法、使用CD3/CD28 Dynabeads的与实施例4同样的刺激方法、或者在CD3/CD28 Dynabeads的基础上还加入了小檗胺(SIGMA、547190)1μM的与实施例4同样的刺激方法这3种方法进行培养，对增殖促进效果进行比较。PBMC饲养细胞用CellTrace CFSE细胞增殖试剂盒-流式细胞仪(CFSE、Invitrogen、100nM)进行标记且进行辐射线照射处理，以识别T-iPS-T细胞。

将与实施例5同样进行了染色和测定的结果示于图10(A)和(B)。如图10(A)和(B)所示，与在饲养细胞存在下相比，通过在小檗胺存在下进行培养，观察到活细胞数的显著增加，未分化细胞数为同等结果。根据以上结果，可以说本发明可以代替T细胞的增殖中一直使用的PBMC。

[实施例8]低分子化合物的筛选

为了进一步评价实施例4中得到的结果，对重现性进行了评价。方法为通过与实施例4相同的方法进行培养、评价。化合物则选择、使用了包括小檗胺在内的实施例4所使用的化合物中的20种化合物，以作为化合物的溶剂的DMSO(0.1％)为对照。需要说明的是，统计分析中使用了t检验(*：p＜0.05)。将结果示于图11。

如图11所示，与DMSO相比，以小檗胺为首的多种化合物确认到细胞数的显著增加，可知小檗胺与DMSO相比促进了iPS-T细胞的增殖。

[实施例9]与有助于记忆性T细胞增殖的已知化合物的比较

对于在T-iPS-T细胞的培养中的影响，对有助于记忆性T细胞增殖的已知化合物与小檗胺进行了比较评价。方法如下：用与实施例4相同的方法，用CD3/CD28 Dynabeads对第一次增殖后的T-iPS-T细胞进行刺激，添加1μM的、作为已知化合物而众所周知的TWS119(Cayman、601514-19-6)(例如Gattinoni et al.,Nat.Med.,15(7):808-813,2009)、(+)-JQ1(abcam、ab146612)(例如Gattinoni et al.,Nat.Med.,15(7):808-813,2009)或小檗胺(BBM、SIGMA公司、547190)中的任一者。以作为化合物的溶剂的DMSO(0.1％)为对照。

用与实施例6相同的培养基培养6天后，通过实施例5的方法将细胞染色并进行测定。将用FlowJo9分析而得到的PI阴性细胞的数量、和PI阴性细胞中的CD45RA(+)CCR7(+)细胞的数量作为数据。需要说明的是，统计分析中使用t检验(*：p＜0.05)。将结果示于图12(A)和(B)。

如图12(A)和(B)所示，对于T-iPS-T细胞而言，上述已知化合物未促进增殖，仅小檗胺显示出显著的增殖效果。对于(+)-JQ1(abcam、ab146612)化合物，还以0.15μM实施了试验，结果与1μM时相同。

以上结果表明，与已知化合物相比，小檗胺在T细胞的培养以及制造中有用。

[实施例10]与MAPK级联抑制剂组合使用所带来的对记忆性T细胞的增殖的效果

研究了小檗胺与MAPK级联抑制剂的组合使用所带来的对记忆性T细胞的增殖的效果。方法如下：通过与实施例4相同的方法用CD3/CD28 Dynabeads对第一次增殖后的T-iPS-T细胞进行刺激，将小檗胺(BBM)和CEP-32496(ERK级联抑制剂、Cayman、18776)、SB-203580(p38级联抑制剂、Cayman、13344)、洛批莫德(p38级联抑制剂、Cayman、13614)或ZM-336372(ERK级联抑制剂、Cayman、10010367)组合添加。将各化合物的终浓度设为1μM。以作为化合物的溶剂的DMSO(0.1％)为对照。

用与实施例6相同的培养基培养6天后，通过实施例5的方法将细胞染色并进行测定。对通过FlowJo9进行分析而得到的PI阴性细胞群中的CD45RA(+)CCR7(+)细胞的数量(#Cells)作图而图形化。需要说明的是，统计分析中使用t检验(*：p＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001)。将结果示于图13。

如图13所示，不仅仅是小檗胺单剂，在所有的组合使用的条件下与DMSO相比均观察到显著的细胞增殖，所有的组合使用的条件与小檗胺单剂相比均观察到细胞增殖的促进。

以上结果表明，通过将小檗胺与ERK级联或p38级联等MAPK级联抑制剂组合使用，与小檗胺单独时相比，能够进一步促进记忆性T细胞的增殖。

[实施例11]小檗胺衍生物对T细胞增殖的影响

检验了小檗胺衍生物对T细胞增殖的影响。方法如下：通过与实施例4相同的方法对第一次增殖后的T-iPS-T细胞进行培养，将小檗胺(BBM)或13种衍生物[BBM1～13、HebeiSundia MediTech Company Ltd.]以终浓度0.1nM、1nM、10nM、100nM或1μM的方式向各孔中分别添加1种，在37℃下在5％CO

培养6天后，使用活细胞数测定试剂SF(Nacalai Tesque、07553)和酶标仪(SoftMaxPro 5.X、Molecular Devices、450nm/650nm)测定活细胞数，将OD值作为数据。需要说明的是，统计分析中，使用t检验(*：p＜0.05)。将结果示于表1。

表1中的参考文献编号如下。

1.Xie et al.,Eur J Med Chem,44(8:3293-8,2009

2.Tan et al.,International Jornal of Mass Spetrometry,386:37-41,2015

3.Nam et al.,Mol Oncol,6(5):484-93,2012

表1中，计算相对于DMSO的值并对小数后第4位进行四舍五入而示出。表1中，*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001。另外，对于实施例6，也同样地进行了统计分析。将结果示于表2。

如表1和表2所示，全部16种衍生物与DMSO相比均观察到显著的细胞增殖的促进。由此可知，小檗胺及其衍生物在T细胞的制造中有用。

[实施例12]T-iPS-T细胞的长期培养

使用小檗胺来评价T-iPS-T细胞的长期培养的可能性。将实验方案示于图14(A)。首先，在不使用饲养细胞的情况下由T-iPS细胞诱导T细胞。关于iPS细胞的维持，无饲养细胞iPS细胞使用StemFit AK02N培养基(Ajinomoto)。在包被有iMatrix-511的培养表面上，使用剥离剂[将1×TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific)用PBS稀释为1/2，添加0.5mol/l-EDTA溶液(pH8、Nacalai Tesque)而使终浓度为0.5×TrypLE Select、0.75mMEDTA]剥离iPS细胞，传代到向StemFit AK02N中加入10μM Y？27632而成的培养基中进行培养(37℃、5％CO

用胚状体形成法对iPS细胞进行分化诱导，由此制作造血祖细胞(HPCs)。将无饲养细胞iPS细胞用0.5×TrypLE Select、0.75mM EDTA剥离后，以2～3×10

次日，向添加了1×胰岛素、转铁蛋白、硒溶液(Thermo Fisher Scientific)、1×Glutamax(Thermo Fisher Scientific)、0.2×PSG、45mM单硫代甘油(Wako)和50μg/ml PAA(Wako)的StemPro34(Thermo Fisher Scientific)培养基(EB培养基)中加入50ng/ml BMP-4(Miltenyi Biotec)、50ng/ml VEGF-165A(Wako)和50ng/ml bFGF(Wako)，进行培养(第1天、5％O

次日添加6μM SB431542(Wako)进行培养(第2天、5％O

2天后，用添加了50ng/ml VEGF-165A、50ng/ml bFGF、50ng/ml SCF、30ng/ml TPO(Wako)和10ng/ml FLT3L(Wako)的EB培养基进行培养(第6天)。之后将细胞在5％CO

使用得到的HPCs对CD4(+)CD8(+)T细胞进行分化诱导。将HPCs以2000～3000个细胞/孔接种到利用Fc-DLL4(5μg/ml、Sino Biological Inc.)和Retronectin(5μg/ml、宝生物)进行了涂覆的48孔板。

使用添加了50ng/ml SCF(Wako)、50ng/ml IL-7(Wako)、50ng/ml Flt3L(Wako)、100ng/ml TPO(Wako)、30μM SDF-1α(Wako)、15μMSB203580(Tocris Bioscience)、55μM 2-巯基乙醇(Wako)、50μg/ml PAA、15％FBS和1％PSG的alpha-MEM培养基培养21天。每周制作新的包被了Fc-DLL4和Retronectin的平板并重新接种细胞。每2～3天进行培养基交换。

接着，对CD8beta(+)CD8alpha(+)T细胞进行诱导。详细而言，将包含上述CD4(+)CD8(+)T细胞的细胞接种于48孔板，用添加了500ng/ml抗CD3抗体OKT3(eBioscience)、10nM地塞米松(デキサートR、Fuji Pharma)、10ng/ml IL-7(Wako)、50μg/mL PAA、15％FBS和1％PSG的alpha-MEM培养基进行培养。

3天后，将培养基交换成10ng/ml IL-7(Wako)、50μg/mL PAA、15％FBS和1％PSG，进行培养。7天后，将细胞用CD8beta-PE(Beckman)、CD8alpha-FITC(BD Bioscience)染色，分选CD8beta(+)CD8alpha(+)T细胞。

接种无饲养细胞分化诱导后的CD8beta(+)CD8alpha(+)T细胞(1500个细胞/孔)，通过与实施例4相同的方法用CD3/CD28 Dynabeads进行刺激，添加小檗胺(BBM)1μM或作为化合物的溶剂的MilliQ作为对照，用与实施例6相同的培养基进行培养。在第14天、第28天和第42天分别回收细胞，用台盼蓝法对活细胞数进行计数，再次进行刺激并培养。在第56天回收细胞，进行活细胞数的计数。将结果示于图14(B)。

如图14(B)所示，观察到加入MilliQ而培养的细胞在每次刺激时活力下降，第42天以后无法继续培养。另一方面，加入小檗胺而培养的细胞能够进行56天培养，而且观察到T-iPS-T细胞的增殖得到促进。

另外，对使用饲养细胞进行分化诱导而得到的T-iPS-T细胞进行了评价。将实验方案示于图15(A)。接种实施例1中进行了分化诱导的T-iPS-T细胞(1500个细胞/孔)，通过与实施例4相同的方法用CD3/CD28Dynabeads进行刺激，添加小檗胺(BBM)1μM或作为化合物的溶剂的MilliQ作为对照，用与实施例6相同的培养基进行培养。在第14天、第28天和第42天分别回收细胞，用台盼蓝法对活细胞数进行计数，再次进行刺激并培养。在第56天回收细胞，进行活细胞数的计数。将结果示于图15(B)。

如图15(B)所示，观察到加入MilliQ而培养的细胞在每次刺激时活力下降，第28天以后不能继续培养。另一方面，加入小檗胺而培养的细胞能够进行56天培养，而且观察到细胞的增殖得到促进。

以往，T细胞的增殖中使用实施例2和实施例7所示的、使用将人类健康人来源PBMC用作饲养细胞的方法(非专利文献1)。根据本实施例的结果，通过添加小檗胺，能够在不使用PBMC的情况下使T细胞长期地增殖，而且观察到细胞增殖的得到促进。

以上结果表明，使用小檗胺的细胞增殖不仅能够代替以往在T细胞的增殖中使用的人PBMC，而且能够使细胞长期地增殖，其结果是能够制造更多的细胞。

[实施例13]对原代T细胞的增殖的影响

研究了小檗胺对原代T细胞(CD4T、CD8T细胞)的增殖的影响。将实验方案示于图16(A)。方法如下：使用人Pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi、130-096-535)由PBMC(CTL公司)纯化CD3T细胞。接种纯化后的CD3T细胞(20000个细胞/孔)，添加小檗胺(BBM)1μM或作为化合物的溶剂的MilliQ作为对照，用CD3/CD28 Dynabeads(60000珠/孔)进行刺激。

用与实施例6相同的培养基培养6天，再度给予刺激。再培养4天后，通过台盼蓝法对活细胞数进行计数，并且通过FACS分析CD4阳性细胞和CD8阳性细胞的比例。FACS中，将与化合物一起培养的细胞转移到96孔板中，用染色液(包含2％FBS的PBS)清洗后，用CD4-BV421(Biolegend、305622)和CD8β-PE(Beckman、IM2217U)进行染色。

清洗后，用200μL/孔的包含PI的染色液进行重悬。使用搭载有HTS的BDLSRFortessa cytometer(BD Bioscience)以100μL/孔进行分析，对全部的细胞进行记录。

将活细胞数乘以通过FlowJo9分析而得到的PI阴性细胞群中的CD8(+)或CD4(+)细胞的阳性率，将所得的值作为CD8阳性细胞数或CD4阳性细胞数。需要说明的是，统计分析中，使用t检验(*：p＜0.05)。将结果示于图16(B)和(C)。

如图16(B)和(C)所示，通过将原代T细胞与小檗胺一起培养，与MilliQ相比，CD4T、CD8T细胞均观察到显著的细胞增殖的促进。CD4T细胞中，包括Th0、Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、Tfh或Treg等。CD8T细胞中，包括Tc、Tc1、Tc2或Tc17等。

以上结果表明，小檗胺与MilliQ相比，促进了CD4T和CD8T细胞的增殖。

[实施例14]在调节性T细胞的增殖中的有用性

检验了小檗胺(BBM)在调节性T细胞(Treg)的增殖中的有用性。方法如下：从3个健康人供体来源的PBMC(CTL公司)中，通过与追加实施例6相同的方法纯化CD3T细胞，培养6天。培养6天后，通过台盼蓝法对活细胞数进行计数，并且通过FACS分析CD25(+)FoxP3(+)细胞的比例。

FACS中，将培养细胞取至facs管中，用染色液(包含2％FBS的PBS)清洗后，用CD3-APC(Biolegend、300412)、CD4-BV510(Biolegend、317444)、CD8-Pacific Blue(BD、558207)和CD25-FITC(Biolegend、302604)进行染色。

再次清洗后，用FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set(eBioscience、00-5523)和FoxP3-PE(eBioscience、12-4776-41)进行细胞内染色，用BDLSRFortessa cytometer(BD Bioscience)进行测定。

将活细胞数乘以通过FlowJo9分析而得到的CD4(+)细胞中的FoxP3(+)细胞的阳性率，将所得的值作为FoxP3阳性细胞数。将结果示于图17(A)和(B)。

如图17(A)和(B)所示，对于全部3个供体而言，观察到与MilliQ相比小檗胺使FoxP3阳性细胞数增加。

以上结果表明，小檗胺与MilliQ相比促进了Treg的增殖。

[实施例15]小檗胺特别起作用的T细胞的分析

非专利文献4报道了T细胞中存在阶段性(图18A)。本实施例中检验了小檗胺在T细胞中所作用的级分。方法如下：将健康人来源PBMC(CTL公司)用染色液(包含2％FBS的PBS)清洗后，用CCR7-APC(Biolegend、353214)、CD45RA-BV510(Biolegend、304142)、CD45RO-APC-Cy7(Biolegend、307228)、CD95-PC-Cy7(Biolegend、305622)和CD8β-PE(Beckman、IM2217U)、CD4-BV421(Biolegend、317434)进行染色。

清洗后，用包含PI的染色液重悬，用BD AriaII Cell Sorter(BD Bioscience)分选出CD8β(+)细胞中的CCR7(+)CD45RA(+)CD95(-)CD45RO(-)作为初始T细胞、分选出CCR7(+)CD45RA(+)CD95(+)CD45RO(+)作为干细胞样记忆性T细胞、分选出CCR7(+)CD45RA(-)CD45RO(+)作为中央记忆性T细胞、分选出CCR7(-)CD45RA(-)CD45RO(+)作为效应记忆性T细胞。

接种各细胞(大约3000个细胞/孔)，添加小檗胺(BBM)1μM或作为化合物的溶剂的MilliQ作为对照，用CD3/CD28 Dynabeads(大约9000珠/孔)进行刺激。使用与实施例6相同的培养基进行培养。

在培养6、9、12和14天后，分别通过台盼蓝法对活细胞数进行计数。统计分析中，使用t检验(*：p＜0.05)。将分选时的门控示于图18B，将细胞计数的结果示于图18C。

如图18B和C所示，在初始T细胞、干细胞样记忆性T细胞中，观察到由小檗胺带来的显著的细胞增殖促进。

以上结果表明，小檗胺作用于包括初始T细胞、干细胞样记忆性T细胞在内的T细胞。

[实施例16]对于细胞在小鼠中的植活的影响

对与小檗胺一起培养的细胞给在小鼠中的植活带来的影响进行了研究。将实验方案示于图19(A)。方法如下：从健康人来源PBMC(CTL公司)中，使用人CD8 T细胞分离试剂盒(Miltenyi、130-096-495)纯化CD8T细胞。

接种经纯化的CD8T细胞(20000个细胞/孔)，添加小檗胺(BBM)1μM或作为化合物的溶剂的MilliQ作为对照，通过与追加实施例6相同的培养基和刺激方法进行培养，将培养10天的细胞作为移植细胞。

作为实验动物，使用6～11周龄雄性NSG小鼠(Japan Charles River)，由尾静脉进行移植(约4x10

FACS中，对脾脏和骨髓进行匀浆处理，对外周血进行溶血处理，之后转移到96孔板，用染色液(包含2％FBS的PBS)进行清洗后，用CD8β-PE-cy7(eBioscience、25-5273-42)和CD45-APC-Cy7(Biolegend、304014)染色。

清洗后，用包含PI的染色液重悬。使用BD LSRFortessa cytometer(BDBioscience)进行分析。测定通过FlowJo9分析而得到的PI阴性细胞群中的CD8β(+)CD45(+)细胞的阳性率。需要说明的是，统计分析中，使用t检验(*：p＜0.05)。将结果示于图19(B)。

如图19(B)所示，对于脾脏、外周血、骨髓而言，相较于与MilliQ一起培养的细胞，与小檗胺一起培养的细胞观察到显著的植活。

以上结果表明，相较于与MilliQ一起培养的细胞，移植与小檗胺一起培养的细胞时促进了生物体内的植活，能够提高此后的增殖和治疗效果。

[实施例17]对NK细胞的增殖促进的影响

研究了小檗胺对NK细胞的作用。将实验方案示于图20(A)。方法如下：从3个健康人供体来源PBMC(CTL公司)中，使用人NK细胞分离试剂盒(Miltenyi、130-092-657)纯化NK细胞。

将纯化前后的NK细胞用染色液(包含2％FBS的PBS)进行清洗后，用CD56-FITC(Biolegend、362546)和CD3-APC-Cy7(Biolegend、300318)进行染色。

清洗后，用包含碘化丙啶的染色液重悬，用BD FACSCantoII Flow Cytometer(BDBioscience)进行测定。确认了通过FlowJo10分析而得到的PI阴性细胞群中的CD3(-)、CD56(+)细胞的比例。将NK细胞纯化前后的FACS图示于图20(B)。

如图20(B)所示，表示NK细胞的CD3(-)、CD56(+)细胞的比例为9成以上，数量充足。接种该经纯化的NK细胞(37000个细胞/孔)，用添加了15％FBS(Biological Industries、04-001-1A)、L-抗坏血酸-2-磷酸酯倍半镁盐水合物(L-asc-2P、50μg/mL、Nacalai Tesque、13570-66)、ITS-G、IL-7(10ng/mL)和IL-15(5ng/mL)的MEM Alpha培养基(gibco、12571-063)进行培养。

向培养基中添加小檗胺(BBM)1μM或作为化合物的溶剂的MilliQ作为对照，培养14天后通过台盼蓝法对活细胞数进行计数。将培养后的细胞数的结果示于图20(C)。

如图20(C)所示，对于全部3个供体而言，与MilliQ相比，小檗胺均使NK细胞数增加。

以上结果表明，小檗胺与MilliQ相比促进了NK细胞的增殖。

使用特定实施方式详细说明了本发明，但是对于本领域技术人员而言，可在不脱离本发明的意图和范围的情况下进行各种各样的变更和变形这一点是不言自明的。需要说明的是，本申请以2018年12月6日提出申请的日本专利申请(日本特愿2018-229478)为基础，将其全部内容通过引用方式援引于此。