MicroRNA-155与NK/T细胞淋巴瘤临床特征的关系及对人NK/T细胞淋巴瘤细胞株SNK-6的生长调控的研究

摘要

目的:通过检测miR-155在NK/T细胞淋巴瘤患者外周血及人K/T细胞淋巴瘤细胞株SNK-6细胞中的表达，探索其与NK/T细胞淋巴瘤临床特征的相关性及其可能的作用机制，以期寻找NK/T细胞淋巴瘤新的肿瘤标记物及预后预测指标。
　　方法:
　　1研究对象:患者血液标本来自于2013年～2014年3月间，就诊于河北医科大学第四医院血液科的NK/T细胞淋巴瘤患者。所有患者均签署知情同意书。正常人外周血来自于河北医科大学自愿者。人NK/T细胞淋巴瘤细胞株SNK-6细胞获赠于郑州大学第一附院。
　　2人NK/T细胞淋巴瘤细胞株SNK-6细胞培养、传代:人NK/T细胞淋巴瘤细胞株SNK-6细胞培养于含体积分数约为15％人AB型血浆、1000u/ml的白介素-2、RPMI1640培养液中，置于37℃、饱和湿度、5％CO2条件的培养箱中培养，48-72h传代一次。此时细胞生长良好，悬浮成团，台盼兰染色拒染率95％以上。本研究相关实验均采用对数生长期SNK-6细胞进行。
　　3基因组miRNA提取:应用miRNA提取试剂盒提取NK/T细胞淋巴瘤患者、正常人外周血标本及SNK-6细胞中的基因组miRNA，以及应用Trizol法提取SNK-6细胞株中的total RNA，提取后将其置于-115℃恒温冰箱中保存备用。
　　4应用Realtime-PCR法检测miR-155表达水平，并分析其与患者预后因素的相关性。
　　5使用siRNA封闭SNK-6细胞中的miR-155后，应用MTT法检测细胞增殖的影响。
　　取SNK-6细胞随机分为未处理组、封闭同源性siRNA对照组和封闭miR-155实验组，siRNA对照组及实验组分别加入siRNA-同源性序列/EndoFectionTM复合物、siRNA-155/EndoFectionTM复合物，作用于细胞48小时后离心收集细胞，后取未处理的细胞、封闭同源性siRNA对照组和封闭miR-155实验组的细胞，均调整密度约为2×105/ml，按200μl/孔接种于U型96孔板，每组均设3个复空，置于37℃、5％CO2、饱和湿度条件的培养箱中孵育，于第24h向各孔中加入20μl MTT(5mg/ml)溶液，置于培养箱内继续孵育4小时，后2500转/分钟，离心培养板20分钟，吸去上清，每孔内加入150μl二甲基亚砜，振荡器振荡至结晶溶解，于酶标仪490nm条件下，测定各孔的吸光度值(OD值)。
　　6封闭miR-155后使用Realtime-PCR检测细胞中NF-κB mRNA表达水平的变化。
　　取SNK-6细胞随机分为未处理组、封闭同源性siRNA对照组和封闭miR-155实验组，siRNA对照组及实验组分别加入siRNA-同源性序列/EndoFectionTM复合物、siRNA-155/EndoFectionTM复合物，作用于细胞48小时后，根据RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒具体实验步骤检测NF-κB的mRNA表达水平。
　　7统计分析:所有数据结果分析应用的SPSS17.0统计软件，P＜0.05，认为有统计学意义。实验数据满足正态性分布的数据采用t检验，不满足正态性分布的数据采用秩转换的非参数检验对患者及正常人外周血两组miR-155基因表达差异进行统计学分析，应用x2检验、多因素分析等对miR-155的表达与NK/T细胞型淋巴瘤患者临床特征进行频率分析。
　　结果:
　　1全部研究对象中，NK/T细胞淋巴瘤患者miR-155表达水平高于正常对照组，说明miR-155在NK/T细胞淋巴瘤患者外周血中存在异常高表达。
　　2在人NK/T细胞淋巴瘤细胞株SNK-6细胞中miR-155存在异常高表达。
　　3 MiR-155在NK/T细胞淋巴瘤临床特征中的分布频率分析，结果显示miR-155与骨髓浸润、分期、Ki-67(％)及NKPI相关，即miR-155的表达水平越高，骨髓浸润几率越大，疾病分期越晚及疾病的危险因素越多。由于以上指标与NK/T细胞淋巴瘤患者预后相关，说明miR-155可能影响其预后。
　　4由于Ki-67(％)是肿瘤细胞增殖活性的一项指标，因此miR-155可能与肿瘤细胞增殖有关。在miR-155封闭后，MTT结果显示SNK-6细胞存活率明显降低，证明miR-155表达促进肿瘤细胞增殖活性。
　　5 Realtime-PCR方法检测封闭miR-155后的细胞中NF-κB mRNA下调，提示NF-κB信号通路是miR-155参与NK/T细胞淋巴瘤的发生机制之一。
　　结论:
　　1在NK/T细胞淋巴瘤中miR-155存在异常高表达，参与NK/T细胞淋巴瘤的发生发展。
　　2 MiR-155与NK/T细胞淋巴瘤细胞增殖相关。
　　3 MiR-155可能与NK/T细胞淋巴瘤的预后相关。
　　4 NF-κB信号通路是miR-155参与NK/T细胞淋巴瘤的发病机制之一。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 研究对象

2 材料

3 实验方法

4 数据处理及统计学分析

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 NK／T细胞淋巴瘤相关MicroRNA的研究进展

致谢

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