声明
第1 章引言
1.1 α-L-鼠李糖苷酶
1.1.1 糖苷水解酶家族简介
1.1.2 α-L-鼠李糖苷酶的结构与催化机理研究
1.1.3 α-L-鼠李糖苷酶的性质与应用
1.2.1 定向进化
1.2.2 理性设计
1.3.1 分子对接
1.3.2 分子动力学模拟
1.4 本论文研究背景及意义
1.5 本论文研究内容
1.5.1 基于序列比对的突变体构建、表达及结构分析
1.5.2 基于分子对接的突变体构建、表达及结构分析
1.5.3 多点突变体构建、表达及结构分析
第2 章材料与方法
2.1.1 菌株及载体
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要培养基及溶液配制
2.1.4 主要实验仪器
2.1.5 PCR 引物
2.2 实验方法
2.2.1 突变位点的确定
2.2.2 质粒的提取
2.2.3 大肠杆菌DH5α 感受态细胞的制备
2.2.4 突变体质粒的构建及转化
2.2.5 阳性突变体的鉴定
2.2.6 突变体质粒线性化及回收
2.2.7 毕赤酵母感受态SMD1168的制备
2.2.8 突变体电转化至毕赤酵母、阳性筛选及鉴定
2.2.9 酵母基因组的提取及鉴定
2.2.10 突变体的诱导表达及分离纯化
2.2.11 SDS-PAGE凝胶电泳检测
2.2.12 蛋白浓度的测定
2.2.13 酶学性质的测定
2.2.14 突变体酶的结构分析
第3 章基于序列比对的突变体构建、表达及结构分析
3.1 突变位点的选择
3.2 大肠杆菌突变体的构建及筛选
3.3 毕赤酵母SMD1168 的转化、筛选及表达
3.4 酶学性质的测定
3.4.1 pNP标准曲线的绘制
3.4.2 各突变体的酶活力分析
3.4.3 突变体R404S 和N578D的动力学参数分析
3.4.4 突变体R404S 和N578D的最适温度及热稳定性分析
3.4.5 突变体R404S 和N578D的最适 pH 及 pH 稳定性分析
3.5.1 圆二色谱的分析
3.5.2 荧光光谱的分析
3.5.3 分子动力学模拟
3.6 本章小结
第4 章基于分子对接的突变体构建、表达及结构分析
4.1 突变位点的选择
4.2 大肠杆菌突变体的构建及筛选
4.3 毕赤酵母SMD1168 的转化、筛选及表达
4.4 酶学性质的测定
4.4.1 各突变体的酶活力分析
4.4.2 各突变体的动力学参数分析
4.4.3 突变体A355N、S356Y和D525N的最适温度及热稳定性分析
4.4.4 突变体A355N、S356Y和D525N的最适pH及pH稳定性分析
4.5 突变体A355N、S356Y 和D525N 的结构分析
4.5.1 圆二色谱的分析
4.5.2 荧光光谱的分析
4.5.3 分子动力学模拟
4.6 本章小结
第5 章 多点突变体构建、表达及结构分析
5.1 突变位点的选择
5.2 大肠杆菌突变体的构建及筛选
5.3 毕赤酵母SMD1168 的转化、筛选及表达
5.4 酶学性质的测定
5.4.1 各突变体的酶活力分析
5.4.2 各突变体的动力学参数分析
5.4.3 各突变体的最适温度及热稳定性分析
5.4.4 各突变体的最适pH 及pH 稳定性分析
5.5.1 圆二色谱的分析
5.5.2 荧光光谱的分析
5.5.3 分子动力学模拟
5.6 本章小结
第6 章结论与展望
6.1 结论
6.2 展望
致 谢
参考文献
在学期间发表的学术论文
集美大学;
