重组右旋糖酐蔗糖酶固定化方法的研究

摘要

右旋糖酐在医药、化工和食品工业中都有重要的应用。目前工业上主要以肠膜样明串珠菌直接发酵法生产右旋糖酐，此方法水解过程引入难以去除的氯离子，降低了产品质量并对环境造成污染。本实验在已经完成重组大肠杆菌高效表达右旋糖酐蔗糖酶研究的基础上，利用酶工程的方法将重组右旋糖酐蔗糖酶进行固定化研究，并对右旋糖酐合成及其分子量控制进行初步探索。
　　 本研究首先分别以Eudragit L-100及羟基磷灰石生物陶瓷吸附、海藻酸钠包埋、戊二醛交联和Ni-NTA亲和吸附等方法对重组右旋糖酐蔗糖酶的固定化进行了初步研究，相较于其他方法最终选择海藻酸钠包埋作为该酶的固定化方法进行研究，因为该法所得的固定化酶活力较稳定，活力回收率可达45％，能重复利用，且成本较低适宜工业化生产。
　　 然后对原有的海藻酸钠包埋该酶的固定化方法进行优化，选择海藻酸钠/琼脂混合法固定化重组右旋糖酐蔗糖酶。经过优化的固定化工艺参数如下：海藻酸钠与琼脂的体积比为1∶1，酶液与包埋材料的体积比为1∶3，固定化形状为薄膜状，缓冲体系搭配为制酶用加0.05g/L CaCl2的0.02mol/L HAc-NaAc缓冲液、底物用0.05 g/L Ca(Ac)2的0.02mol/L HAc-NaAc缓冲液，氯化钙浓度为1.5％，固定化温度为0℃，固定化时间为15min。以蔗糖为底物，该固定化酶的最适反应温度为40℃，最适pH为5.4，最适底物浓度为5％，动力学常数Km值为28.35mmol/L。结果表明重组右旋糖酐蔗糖酶经海藻酸钠和琼脂固定化后稳定性提高，与游离酶相比可以较长时间保持很高的活力，固定化酶可以反复使用6次以上，酶活回收率可达40％以上，且最适反应温度较游离酶提高了10℃。
　　 在海藻酸钠/琼脂混合法固定化重组右旋糖酐蔗糖酶的基础上引入吸附剂羟基磷灰石继续改良上述固定化方法，利用吸附-包埋协同固定化右旋糖酐蔗糖酶。优化后的工艺参数为：吸附温度10℃，羟基磷灰石用量0.05g/ml，吸附时间10h，其他参数不变。以蔗糖为底物，该固定化酶的最适反应温度为302，最适pH为4.2，最适底物浓度为5％，动力学常数Km值为30.56mmol/L。结果表明包埋前先以羟基磷灰石吸附较之前单纯使用海藻酸钠和琼脂包埋使固定化酶活力提高了15倍，且固定化酶的pH稳定性也有明显提高。
　　 最后，利用固定化酶合成右旋糖酐并对其分子量进行调控进行了初步研究，结果发现右旋糖酐酶的引入能够有效控制产物的分子量。通过控制右旋糖酐蔗糖酶与右旋糖酐酶的比例、反应时间、蔗糖浓度、反应温度和pH可以一步合成所需分子量的右旋糖酐。且利用固定化双酶合成的方法可以避免外源蛋白的引入，利于提高产品的药用安全性。在吸附-包埋协同固定化的条件下，当右旋糖酐酶与右旋糖酐蔗糖酶的活力配比在1∶60时，酶促反应4h所得右旋糖酐的分子量达到20000，且产物分子量随右旋糖酐酶比例的增大而降低。这些研究为右旋糖酐的酶法合成及其在工业上的应用提供了重要参数。

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致谢

第一章概述

1.1引言

1.2右旋糖酐蔗糖酶

1.3右旋糖酐酶

1.4右旋糖酐

1.5固定化方法

1.6本研究的内容和意义

第二章 重组右旋糖酐蔗糖酶不同固定化方法的初步研究

2.1引言

2.2实验部分

2.2.1实验材料

2.2.2实验方法

2.2.3实验结果

2.3讨论

第三章 海藻酸钠／琼脂混合法固定化重组右旋糖酐蔗糖酶

3.1引言

3.2实验部分

3.2.1实验材料

3.2.2实验方法

3.2.3实验结果

3.3讨论

第四章 吸附-包埋法固定化重组右旋糖酐蔗糖酶

4.1引言

4.2实验部分

4.2.1实验材料

4.2.2实验方法

4.2.3实验结果

4.3讨论

第五章 重组右旋糖酐蔗糖酶与右旋糖酐酶联合固定化生产右旋糖酐

5.1引言

5.2实验部分

5.2.1实验材料

5.2.2实验方法

5.2.3实验结果

5.3讨论

第六章 结论和展望

6.1结论

6.2展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文