丙酮丁醇梭菌的选育及其发酵产丁醇研究

摘要

丁醇作为一种重要的四碳平台化合物,已广泛应用于医药、化工等领域。随着石油资源的枯竭和环境压力的加剧,丁醇作为一种极具开发潜力的可再生能源倍受人们的高度关注。玉米秸秆是自然界中储量非常丰富的可再生资源,采用廉价的秸秆代替传统的玉米及糖蜜发酵产丁醇可以很大程度上减少丁醇生产成本。本文采用复合诱变的方法对丙酮丁醇梭菌进行选育;通过高产突变株发酵工艺的优化,获得最适发酵条件;并对玉米秸秆水解液发酵产丁醇的效果进行了初步研究,得到如下主要结果:
　　 1、采用紫外线与甲基磺酸乙酯复合诱变丙酮丁醇梭菌CICC8012的较适条件为紫外照射120 s,5％(v/v)甲基磺酸乙酯处理60 min;经溴甲酚绿平板初筛和发酵复筛,最终得到1株高产丁醇突变株M-31;突变株发酵葡萄糖产总溶剂10.39 g/L,其中丁醇产量为6.55 g/L,较原始菌株分别提高了16.48％和20.62％:经6次传代接种,突变株M-31丁醇产量较稳定。
　　 2、通过Plackett-Burman及Box-Behnken响应面设计,得到突变株M-31最适的培养基组成为:初始糖49 g/L、(NH4)2SO43 g/L、酵母浸粉1.5 g/L、MgSO4·7H2O0.37 g/L、KH2PO41 g/L、FeSO4·7H2O15 mg/L、CaCO34.45 g/L和L-半胱氨酸盐酸盐0.75 g/L;正交试验获得突变株M-31最适发酵条件为:温度37℃,初始pH5.5、接种量5％、装液量80％、热激时间为60 s。此条件下,总溶剂产量达到15.26 g/L,其中丁醇产量为9.57 g/L。
　　 3、考察玉米秸秆水解液中有毒成分对丁醇发酵的影响,结果表明糠醛含量超过1 g/L时,严重抑制菌体生长和产物合成;不同方法对玉米秸秆水解液脱毒的效果显示,亚硫酸盐法虽然总糖损失率较高,但水解液中的糠醛含量最少,仅为对照组的25.62％,并且发酵终点时生物累积量和丁醇质量浓度最高,分别较对照组提高42.34％和16.59％。
　　 4、对突变株M-31发酵脱毒玉米秸秆水解液的碳源、氮源及无机盐浓度进行考察,得到的较优条件为:初始秸秆水解液80 g/L,、(NH4)2SO43 g/L、KH2PO40.3 g/L、MgSO4·7H2O0.3 g/L和FeSO4·7H2O15 mg/L,此条件下发酵72 h,丁醇产量为5.53 g/L,较优化前提高了65.57％。

目录

文摘

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致谢

论文说明:图表目录

第一章 绪论

1.1 丁醇的性质及应用

1.1.1 丁醇的性质

1.1.2 丁醇的应用

1.1.3 丁醇的主要生产方法

1.2 生物丁醇研究进展

1.2.1 生物丁醇菌种及其代谢机理

1.2.2 菌种的改良

1.2.3 发酵底物与工艺的研究现状

1.3 本课题研究的目的、意义及主要内容

1.3.1 研究的目的和意义

1.3.2 研究的主要内容

第二章 高产丙酮丁醇梭菌的选育

2.1 材料与方法

2.1.1 菌种与试剂

2.1.2 仪器与设备

2.1.3 培养基与培养方法

2.1.4 分析方法

2.2 实验方案

2.2.1 紫外线诱变

2.2.2 甲基磺酸乙酯诱变

2.2.3 复合诱变

2.2.4 高产菌株的筛选

2.2.5 高产突变株与原始菌株发酵特性比较

2.3 结果与分析

2.3.1 紫外线诱变效果

2.3.2 甲基磺酸乙酯处理结果

2.3.3 复合诱变后高产突变株的筛选结果

2.3.4 高产突变株遗传稳定性考察结果

2.3.5 突变株M-31与原始菌株发酵特性比较结果

2.4 小结

第三章 高产丁醇突变株M-31的发酵工艺优化

3.1 材料与方法

3.1.1 菌种

3.1.2 试剂与设备

3.1.3 培养基与培养方法

3.1.4 分析方法

3.2 实验方案

3.2.1 培养基单因素试验

3.2.2 培养基Plackett-Burman试验

3.2.3 培养基Box-Behnken试验

3.2.4 发酵条件单因素试验

3.2.5 正交试验优化最适发酵条件

3.3 结果与分析

3.3.1 培养基单因素试验结果

3.3.2 培养基Plackett-Burman试验结果

3.3.3 培养基Box-Behnken试验结果

3.3.4 发酵条件单因素试验结果

3.3.5 发酵条件正交试验优化的结果

3.4 小结

第四章 突变株M-31利用秸秆水解液产丁醇研究

4.1 材料与方法

4.1.1 菌种与原料

4.1.2 试剂与设备

4.1.3 培养基与培养方法

4.1.4 分析方法

4.2 实验方案

4.2.1 糠醛质量浓度对发酵效果的影响

4.2.2 不同玉米秸秆水解液脱毒方法研究

4.2.3 脱毒秸秆水解液发酵产丁醇试验

4.2.4 高产突变株M-31利用脱毒秸秆水解液发酵特性试验

4.3 结果与分析

4.3.1 糠醛质量浓度对发酵效果的影响

4.3.2 不同水解液脱毒方法研究试验结果

4.3.3 脱毒秸秆水解液发酵产丁醇试验结果

4.3.4 突变株M-31利用脱毒秸秆水解液发酵过程曲线

4.4 小结

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文