罗非鱼鱼油的提取及其纳米脂质体的制备和性质研究

摘要

鱼油中含有二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等多不饱和脂肪酸，其中ω-3型多不饱和脂肪酸(PUFA)具有特殊的生物活性，在生物系统中有着广泛的功能。然而不饱和脂肪酸极易发生氧化，同时鱼油的腥味和水不溶性也极大的限制了其在食品中的应用。作为一种新型的微囊制备技术，脂质体可以有效解决这一问题。因此，本文研究了鱼油的提取方法，然后以鱼油为芯材，采用脂质体技术对鱼油进行包埋，最后研究了鱼油及其纳米脂质体对大鼠肝脏部分缺血再灌注损伤(IRI)的保护作用和可能的机制。
　　本实验以罗非鱼内脏为原料，采用酶法提取鱼油，并对提取鱼油的基本理化性质和脂肪酸组成进行分析。通过单因素实验和响应面法优化得到酶法提取罗非鱼内脏鱼油的最佳工艺条件为:酶解温度50℃、pH7.5、液料比5∶1(mL/mg)、加酶量3400 U/g、酶解时间1h。在此条件下，鱼油提取率达到88.95％。GC-MS分析结果显示，罗非鱼内脏粗鱼油和精炼鱼油饱和脂肪酸(SFA)的相对含量为36.66％-32.19％，以棕榈酸为主;单不饱和脂肪酸(MUFA)的相对含量为38.13％-39.05％，以油酸为主;多不饱和脂肪酸（PUFA）的相对含量为25.18％-29.31％，以亚油酸为主。结果表明罗非鱼内脏鱼油是一种营养品质较高的油脂。
　　采用薄膜分散-超声法制备传统鱼油纳米脂质体(un-L)和羧甲基壳聚糖包覆的纳米脂质体(CM-L)，考察了un-L和CM-L的主要理化性质，储藏稳定性以及体外释放性。结果表明，随着羧甲基壳聚糖(CMCS)浓度的增加，包覆脂质体的平均粒径由97.70 nm增至218.15 nm，但其包封率变化不大。储藏稳定性实验表明4℃贮存的脂质体各指标稳定性均高于25℃。对载有鱼油的脂质体进行体外释放研究发现二者在模拟胃液和肠液中均先经历突释，然后缓慢释放的过程。对实验数据进行了模型参数的拟合，通过对不同模型参数的比较，表明一级动力学模型能够预测鱼油在体内的缓释性，其释放机理可能是扩散和溶蚀两种作用的综合结果。
　　建立SD大鼠部分IRI模型(70％)。将60只雄性大鼠随机分成5组:假手术组（S组），缺血再灌注组（IR组），鱼油预处理组（FO组），传统鱼油纳米脂质体预处理组（un-L组），羧甲基壳聚糖包覆的鱼油纳米脂质体预处理组（CM-L组），分别于IR后2、6、24 h处死大鼠，收集肝组织和血清，测定血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、谷氨酞转移酶(γ-GT)、乳酸脱氢酶(LDH)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和肝组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶(MPO)以及肝组织的病理变化。结果表明，与S组比较，IR组的ALT、AST、γ-GT、LDH、MDA、MPO、TNF-α和IL-6显著增加(P＜0.05)，而SOD和IL-10显著降低(P＜0.05);与IR组比较，经鱼油、un-L和CM-L预处理组ALT、AST、γ-GT、LDH、MDA、MPO、TNF-α和IL-6显著降低(P＜0.05)，而SOD和IL-10显著增加(P＜0.05)。肝组织切片观察表明与IR组相比，鱼油组、un-L组和CM-L组的肝组织病理损伤程度减轻，TUNEL阳性肝细胞数量减少，NF-κBp65蛋白表达显著降低。结果表明膳食补充鱼油、un-L和CM-L对大鼠肝脏IRI均有保护作用，并且可为改善肝脏IRI提供有效的营养治疗途径。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 鱼油的研究及应用

1．1．1 我国淡水鱼加工利用现状

1．1．2 鱼油提取工艺

1．1．3 鱼油的微胶囊化

1．2 脂质体的研究及应用

1．2．1 脂质体简介

1．2．2 包覆脂质体的研究进展

1．2．3 脂质体的应用

1．3 肝脏缺血再灌注损伤

1．4 课题研究背景、意义及主要内容

1．4．1 课题来源

1．4．2 课题研究背景、意义

1．4．3 论文主要内容

第二章 酶法提取罗非鱼内脏鱼油及脂肪酸组成分析

2．1 材料与仪器

2．1．1 材料与试剂

2．1．2 仪器与设备

2．2 实验方法

2．2．1 原料的预处理

2．2．2 鱼内脏基本成分测定

2．2．3 内脏鱼油的提取方法比较

2．2．4 鱼油提取率的计算

2．2．5 内脏鱼油提取工艺条件的确定

2．2．6 粗鱼油的精炼

2．2．7 鱼油理化性质测定

2．2．8 鱼油脂肪酸组成分析

2．3 数据分析

2．4 结果与讨论

2．4．1 罗非鱼内脏的基本成分

2．4．2 不同方法提取罗非鱼内脏鱼油的比较

2．4．3 蛋白酶的筛选

2．4．4 单因素实验

2．4．5 酶解工艺参数的响应面优化

2．4．6 理化性质测定

2．4．7 脂肪酸组成分析

2．5 本章小结

第三章 鱼油纳米脂质体的制备和性质研究

3．1 材料与仪器

3．1．1 材料与试剂

3．1．2 仪器与设备

3．2 实验方法

3．2．1 un-L和CM-L的制备

3．2．2 包封率的测定

3．2．3 粒径的测定

3．2．4 包覆物用量的考察

3．2．5 形态学观察

3．2．6 红外光谱分析

3．2．7 差示扫描量热分析

3．2．8 X-射线衍射分析

3．2．9 稳定性研究

3．2．10 体外释放实验

3．3 数据分析

3．4 结果与讨论

3．4．1 鱼油脂质体最佳吸收波长的选择

3．4．2 包覆物用量对脂质体的影响

3．4．3 形态学观察

3．4．4 红外光谱分析

3．4．5 差示扫描量热分析

3．4．6 X-射线衍射分析(XRD)

3．4．7 稳定性研究

3．4．8 体外释放研究

3．5 本章小结

第四章 鱼油及其纳米脂质体对大鼠肝脏缺血再灌注损伤(IRI)的保护作用

4．1 材料与仪器

4．1．1 实验动物

4．1．2 材料与试剂

4．1．3 仪器与设备

4．2 实验方法

4．2．1 动物模型的建立

4．2．2 实验分组

4．2．3 样本采集

4．2．4 生化指标检测

4．2．5 细胞因子检测

4．2．6 组织学检查

4．2．7 TUNEL法检测细胞调亡

4．2．8 免疫组化法检测肝组织NF-κBp65的表达

4．3 数据分析

4．4 结果与讨论

4．4．1 大鼠肝脏部分缺血再灌注损伤模型的建立

4．4．2 血清ALT和AST水平的变化

4．4．3 血清LDH水平的变化

4．4．4 血清γ-GT水平的变化

4．4．5 肝组织MDA、SOD水平的变化

4．4．6 组织MPO水平的变化

4．4．7 血清TNF-α、IL-6和IL-10水平的变化

4．4．8 组织学检查

4．4．9 细胞调亡检测

4．4．10 肝组织NF-κBp65的表达的变化

4．5 本章小结

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

攻读硕士期间的表现