唑来膦酸对破骨细胞分化中钙离子振荡和CaMKII、CaMKIV、NFATc1基因表达的影响

摘要

目的：利用RANKL诱导小鼠白血病单核巨噬细胞RAW264.7细胞株构建体外破骨细胞培养体系，研究唑来膦酸对体外破骨细胞分化成熟过程中钙离子振荡和钙离子下游关键信号分子CaMKII、CaMKIV、NFATc1基因表达的影响，从分子水平探讨唑来膦酸对破骨细胞分化和骨吸收功能抑制的作用，进而进一步揭示唑来膦酸对破骨细胞抑制作用的机理。　　方法：1建立RAW264.7细胞体外培养体系，首先探讨不同浓度的唑来膦酸对细胞增殖的影响。将细胞分为7组：A组，为对照组；B组~G组，分别用1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、5×10-6mol/L、1×10-5mol/L、5×10-5mol/L和1×10-4mol/L浓度的唑来膦酸处理细胞。除A组外，其他各组用ZOL作用5d，然后应用倒置相差显微镜对细胞形态进行观察，并应用噻唑蓝（MTT）实验检测RAW264.7细胞增殖情况。2将RAW264.7细胞分为对照组和唑来膦酸（ZOL）处理组，以探讨唑来膦酸对破骨细胞生成、Ca2+振荡、CaMKII、CaMKIV、NFATc1基因表达的影响。两组细胞均用RANKL诱导5d，而 ZOL组在 RANKL诱导1d后，加用1×10-6mol/L的唑来膦酸处理2d。细胞收获后，进行如下检测：（1）应用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及牙本质磨片吸收陷窝检测评价两组细胞破骨细胞生成及骨吸收情况；（2）钙离子振荡检测：两组细胞在1×10-6mol/L的ZOL处理后0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h（ZOL去除后24h）、96h（ZOL去除后48h），在激光共聚焦显微镜下应用荧光染料Fluo-4、Fluo-red检测破骨细胞分化过程中钙离子振荡情况，评价唑来膦酸对破骨细胞分化过程中钙离子振荡的影响。（3）两组细胞应用RANKL诱导5d后，收获细胞，分别应用Real-time PCR、免疫荧光细胞化学、western-blot技术检测两组细胞CaMKII、CaMKIV、NFATc1基因表达情况。　　结果：1唑来膦酸浓度为（1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、5×10-6mol/L）时对RAW264.7细胞的增殖不产生影响，没有统计学意义（P＞0.05），而浓度为1×10-5mol/L时对RAW264.7细胞的增殖有轻微的抑制作用，但细胞形态及大小没有明显变化，而浓度为5×10-5mol/L、1×10-4mol/L对RAW264.7细胞增殖受到明显抑制，细胞数目明显下降，部分细胞体积变小，部分细胞发生崩解，呈碎屑状（P＜0.01）。2经RANKL诱导及唑来膦酸处理后，对照组和唑来膦酸（ZOL）处理组检测结果如下：（1）TRAP染色及牙本质磨片吸收陷窝检测显示，两组细胞都有TRAP+多核破骨细胞形成（胞核≥3个）和有骨吸收陷窝出现，但是唑来膦酸处理组破骨细胞数目、牙本质磨片吸收陷窝的数目和面积分别为33.0±1.0，46.0±3.5和4125.9±674.8μm2，显著低于对照组的66.6±3.2，86.0±9.2和9418.3±1260.8μm2（P＜0.05或 P＜0.01）。（2）唑来膦酸对钙离子振荡的影响具有时间依赖性：1×10-6mol/L的唑来膦酸在作用初期（0~3h），对钙离子振荡没有明显的抑制作用；而随着作用时间的延长（6~48h），唑来膦酸对钙离子振荡产生了明显的抑制作用，且随着时间的延长抑制作用越来越明显；在唑来膦酸撤除后（72~96h），钙离子振荡逐渐恢复，上升到与对照相似的水平。（3）Real-time PCR检测显示，唑来膦酸处理组CaMKII、CaMKIV、NFATc1 mRNA水平较对照组均显著降低，分别下降了39.3％和51.7%和54.7%（P＜0.01）。（4）Western-blot检测显示，唑来膦酸处理组CaMKII、CaMKIV、NFATc1的蛋白表达水平较对照组显著降低，蛋白条带灰度值分别下降了58.9％、46.8％和39.8%（P＜0.05）。免疫荧光细胞化学检测也显示，唑来膦酸处理组CaMKII、CaMKIV、NFATc1蛋白荧光强度均显著低于对照组（P＜0.05）。　　结论：研究结果提示，唑来膦酸盐可显著抑制破骨细胞生成及胞内钙离子振荡，并下调CaMKII、CaMKIV、NFATc1基因表达；钙信号分子CaMKII、CaMKIV、NFATc1可能参与了唑来膦酸对破骨细胞分化的抑制，并在其中发挥极其重要的作用。

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引言

第1章 实验研究

1.1 材料

1.1.1 试剂和药物

1.1.2 仪器和设备

1.2 实验方法

1.2.1 RAW264.7细胞的培养

1.2.2 不同浓度唑来膦酸对RAW264.7细胞增殖的影响

1.2.3 唑来膦酸对破骨细胞生成和功能的影响

1.2.4 唑来膦酸对破骨细胞分化中钙离子波动的影响

1.2.5 唑来膦酸对破骨细胞分化中信号分子CaMKII、CaMKIV、NFATc1基因表达

1.2.6 统计学分析

1.3 结果

1.3.1 唑来膦酸对RAW264.7细胞增殖的影响

1.3.2 唑来膦酸对破骨细胞生成和功能的影响

1.3.3 唑来膦酸对破骨细胞分化中钙离子振荡（Ca2+oscillation）的影响

1.3.4 唑来膦酸对破骨细胞分化过程中CaMKII、CaMKIV、NFATc1表达的影响

1.4 讨论

1.4.1 破骨细胞与唑来膦酸

1.4.2 钙离子振荡在唑来膦酸抑制OC分化和功能的作用

1.4.3 CaMKII/IV在唑来膦酸抑制OC分化和功能的作用

1.4.4 NFATc1在唑来膦酸抑制OC分化和功能的作用

1.5 小结

参考文献

第2章 综 述:钙离子信号通路在破骨细胞分化过程中的相关研究背景

2.1 Ca2+-NFATc1信号通路在破骨细胞中的作用

2.2 NFATc1在破骨细胞中的作用

2.2.1 NFATc1的结构

2.2.2 NFATc1的作用机制

2.3 钙离子振荡在破骨细胞中的作用

2.3.1 钙离子在破骨细胞中的作用和钙离子的诱发因素

2.3.2 钙离子在破骨细胞中的作用机制

2.4 CaMKs在破骨细胞中的作用

2.4.1 CaMKs对破骨细胞的作用和分类

2.4.2 CaMKII的生物学特性

2.4.3 CaMKII在破骨细胞分化中的作用及机制

2.4.4 CaMKIV的生物学特性

2.4.5 CaMKIV在破骨细胞分化中的作用及机制

2.5 总结与展望：

参考文献

结论

致谢

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