猪GM-CSF双抗体夹心ELISA的建立及其初步应用

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 猪繁殖与呼吸综合征概述

1.1.1 PRRSV 的生物学特性

1.1.2 PRRSV 感染后机体的免疫应答

1.2 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）概述

1.2.1 GM-CSF生物学特性

1.2.2 GM-CSF的功能

1.2.3 GM-CSF在病毒性疾病中的作用

1.2.4 GM-CSF在PRRSV 中的作用

1.3 本研究的目的与意义

第二章 抗pGM-CSF鼠源单克隆抗体和兔源多克隆抗体的制备、纯化以及活性鉴定

2.1 试验材料

2.1.1 质粒、菌种、实验动物细胞及抗体

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.2 主要溶液配制

2.2.1 载体构建相关试剂的配制

2.2.2 蛋白表达与分离纯化相关试剂的配制

2.2.3 SDS-PAGE 主要试剂配制

2.2.4 腹水纯化相关试剂的配制

2.2.5 4B 耦联相关试剂配制

2.2.6 ELISA主要试剂配制

2.2.7 其他主要试剂配制

2.3 试验方法

2.3.1 pET28a-pGM-CSF与VenusC1-pGM-CSF重组载体的构建

2.3.2 重组pGM-CSF蛋白的表达与纯化

2.3.3 重组pGM-CSF蛋白的免疫

2.3.4 细胞融合

2.3.5 阳性融合细胞的鉴定及亚克隆

2.3.6 抗pGM-CSF单克隆抗体的纯化及亚型鉴定

2.3.7 抗pGM-CSF单克隆抗体的活性鉴定

2.3.8 多克隆抗体的纯化与活性鉴定

2.3.9 抗pGM-CSF的单抗及多抗捕获和识别过表达的pGM-CSF 的能力的检测

2.4 试验结果

2.4.1 pGM-CSF重组载体的构建

2.4.2 重组pGM-CSF蛋白的表达与纯化

2.4.3 抗pGM-CSF单克隆抗体的制备及纯化

2.4.4 抗pGM-CSF单克隆抗体活性鉴定

2.4.5 抗pGM-CSF多克隆抗体的纯化及活性鉴定

2.4.6 抗pGM-CSF的单抗及多抗捕获和识别过表达的pGM-CSF 的能力的检测

2.5 讨论

2.6 小结

第三章 抗pGM-CSF双抗体夹心ELISA检测方法的建立

3.1 实验材料

3.1.1 蛋白

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要试剂配置

3.2 主要仪器设备

3.3 试验方法

3.3.1 双抗体夹心ELISA封闭液和抗体浓度的确定

3.3.2 双抗体夹心ELISA孵育温度和时间的摸索

3.3.3 双抗体夹心ELISA特异性和敏感性的检测

3.4 试验结果

3.4.1 双抗体夹心ELISA封闭液和抗体浓度的确定

3.4.2 双抗体夹心ELISA孵育温度和时间的确定

3.4.3 双抗体夹心ELISA检测流程的确定

3.4.4 双抗体夹心ELISA特异性和敏感性的确定

3.5 讨论

3.6 小结

第四章 pGM-CSF双抗体夹心ELISA检测方法的初步应用

4.1 试验材料

4.2 仪器设备

4.3 试验方法

4.3.1 PRRSV 增殖与病毒滴度测定

4.3.2 检测PRRSV 不同毒株感染PAMs 后pGM-CSF转录水平的表达

4.3.3 PRRSV 不同毒株感染PAMs 后pGM-CSF蛋白水平的表达

4.3.4 临床血清中pGM-CSF蛋白含量的检测

4.4 试验结果

4.4.1 PRRSV 不同毒株感染PAMs 后pGM-CSF转录水平表达上调

4.4.2 PRRSV 不同毒株感染PAMs 后pGM-CSF蛋白水平表达的检测

4.4.3 临床血清样本中pGM-CSF蛋白含量的检测

4.5 讨论

4.6 小结

结论

参考文献

附录

致谢

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