抗猪IFN-β和IFN-γ单克隆抗体的制备及猪IFN-β双抗体夹心ELISA方法的初步建立

摘要

免疫功能可以分为天然免疫和获得性免疫两部分。机体的天然免疫应答是机体抵抗病原微生物(病毒、细菌等)入侵的第一道防线，同时也是获得性免疫的基础。Ⅰ型干扰素的分泌和表达是天然免疫的一个重要方面，它包括IFN-α和IFN-β。和Ⅰ型干扰素相比Ⅲ型干扰素只能由NK细胞、CD8+T细胞、CD8+T细胞Th亚群产生，包括IFN-γ，它是重要的免疫调节因子又被称为免疫干扰素。本研究制备了IFN-β和IFN-γ的单克隆抗体并利用制备的单克隆抗体初步建立了猪IFN-β的双抗体夹心ELISA方法，具体工作如下：
　　 1.猪IFN-β、IFN-γ基因的克隆和表达
　　 根据GenBank提交的猪IFN-β、IFN-γ的序列，设计特异性引物，以PK-15细胞RNA为模板通过RT-PCR扩增获得猪IFN-β基因和IFN-γ基因，大小分别为498bp和444bp。将PCR产物分别克隆到原核表达载体pET-28a和真核载体pCAGGS-HA中，获得猪IFN-β和IFN-γ基因的原核表达质粒和真核表达质粒。将猪IFN-β和IFN-γ基因的原核表达质粒分别转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导后，两种质粒均能正确表达相应的蛋白，并且表达的猪IFN-β主要以包涵体形式存在，而猪IFN-γ主要以可溶性形式存在。将猪IFN-β和IFN-γ基因的真核表达质粒分别转染Hela细胞，经Western blot证实两种质粒均能在体外培养细胞中正确表达相应的蛋白。
　　 2.抗猪IFN-β、IFN-γ单克隆抗体的制备
　　 以原核表达蛋白免疫BALB/C小鼠，进行二次免疫后断尾采血检测免疫效价并进行细胞融合。当血清效价达到1:6400后取脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，利用间接ELISA进行筛选，共筛选到抗猪IFN-β的单克隆抗体4株，抗猪IFN-γ的单克隆抗体8株，并经Western blot和间接免疫荧光证实所得单克隆抗体均能与真核表达的相应蛋白发生特异性的反应。
　　 3.抗猪IFN-β的单克隆抗体的纯化和酶标
　　 将获得的4株分泌抗猪IFN-β单克隆抗体的杂交瘤细胞扩大培养后接种BALB/C小鼠制备腹水，经辛酸-硫酸铵法纯化后，用SDS-PAGE检测证实获得了纯度高的单抗，紫外分光光度计检测纯化后4株单克隆抗体的浓度分别为2D126.9mg/ml、4A64.2 mg/ml、2H63.4 mg/ml、4G72.5 mg/ml。将纯化后的单抗用辣根过氧化物酶(HRP)标记，每株抗体标记3mg，标记完成后用间接ELISA检测效价。检测4株酶标抗体的效价分别为2D121:12800、4A61:12800、2H61:32004G71:1000。
　　 4.猪IFN-β双抗体夹心ELISA方法的初步建立及应用
　　 以CHO细胞表达的猪IFN-β为抗原，将4株纯化抗体和酶标抗体两两配对进行双抗体夹心实验，结果当以2D12为包被抗体、以4A6为酶标抗体时，建立的ELISA方法的特异性和敏感性最好。进一步优化条件最终确定包被抗体的最佳包被浓度为2μg/ml，酶标抗体的最佳稀释度为1:2000。同时以真核表达的猪IFN-β为抗原建立标准曲线，初步建立了能够检测猪IFN-β的双抗体夹心ELISA法后。以建立的ELISA方法检测了PRV刺激PAM细胞后不同时间的细胞上清中的IFN-β，检测结果显示随着刺激时间的延长，IFN-β的量逐渐增多，与预期的实验结果相符。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表(ABBREVIATION)

1 文献综述

1.1 干扰素的概况

1.2 病毒与宿主细胞的对抗

2 研究目的与意义

3 材料与方法

3.1 实验材料

3.1.1 细胞、菌株、毒株及相关蛋白

3.1.2 构建载体所需要的材料、试剂和培养基

3.1.3 蛋白表达及纯化所需材料和试剂

3.1.4 SDS-page和western-blot所需试剂和材料

3.1.5 ELISA所需的材料和试剂

3.1.6 细胞培养所需的材料和试剂

3.1.6 细胞转染所需的材料和试剂

3.1.7 单抗纯化酶标所需的材料和试剂

3.2 实验方法

3.2.1 引物的设计

3.2.2 细胞总RNA的提取

3.2.3 目的片段的扩增

3.2.4 目的片段和载体的酶切及连接

3.2.5 连接产物的转化

3.2.6 重组质粒的鉴定

3.2.7 原核蛋白的表达

3.2.8 确定蛋白的表达形式

3.2.9 包涵体的提取方法

3.2.10 可溶性蛋白的纯化方法

3.2.11 细胞转染(脂质体介导转染法，Lipofectine2000)

3.2.12 动物免疫

3.2.13 骨髓瘤细胞的准备

3.2.14 饲养细胞的准备

3.2.15 免疫脾细胞的制备

3.2.16 细胞融合

3.2.17 阳性细胞孔的筛选

3.2.18 阳性细胞的克隆

3.2.19 单克隆抗体的大量制备

3.2.20 单克隆抗体的验证

3.2.21 单抗的纯化

3.2.22 单抗的酶标

4 结果与分析

4.1 猪IFN-β和IFN-γ基因的克隆与表达

4.1.1 猪IFN-β和IFN-γ的扩增

4.1.2 猪IFN-β和IFN-γ原核表达质粒和真核表达质粒的构建

4.1.3 猪IFN-β和IFN-γ的原核表达

4.2 猪IFN-β和IFN-γ单克隆抗体的制备

4.2.1 Balb/C小鼠的免疫与分泌特异性单克隆抗体细胞株的筛选

4.2.2 western-blot验证单克隆抗体

4.2.3 间接免疫荧光验证单克隆抗体

4.3 猪IFN-B双抗体夹心ELISA方法的初步建立

4.3.1 单抗腹水的制备与效价测定

4.3.2 抗猪IFN-β单克隆抗体的纯化

4.3.3 抗猪IFN-β单克隆抗体酶标后效价检测

4.3.4 确定4株单抗是否针对不同的抗原表位

4.3.5 方阵滴定确定包被抗体与酶标抗体的最佳工作浓度

4.3.6 CHO细胞系表达的猪IFN-β作为抗原进行双抗体夹心

4.3.7 标准曲线的建立

4.3.8 PRV刺激PAM取细胞上清进行双抗体夹心ELISA

5 讨论与结论

5.1 讨论

5.1.1 免疫原的制备

5.1.2 小鼠免疫效价低的问题

5.1.3 阳性克隆的筛选

5.1.4 原核蛋白与真核蛋白问题

5.1.5 酶标抗体的酶标效果

5.1.6 双抗体夹心ELISA法标准曲线的建立

5.2 结论

参考文献

致谢