重组酶β蛋白、β蛋白177、FLP基因的合成、表达及活性检测

摘要

体内重组工程是一种近年来兴起的新型遗传工程技术。它基于重组酶和体内同源重组反应，可以摆脱传统重组技术的限制性内切酶的束缚，减少了繁杂的酶切、连接步骤，达到了简化实验操作、缩短实验周期的目的；通过重组酶的介导，大大提高了重组的高效性、精确性和适应性，被认为是自PCR技术诞生以来基因工程中最为重要的进展和突破，并具有取代传统DNA重组技术的趋势。重组酶β蛋白可以作为单链退火蛋白，促进DNA互补链的退火，提高同源重组效率；重组酶FLP可以识别FRT位点，完成位点间DNA序列的交换、重组、删除与逆转；并且已成功应用于多种微生物菌种的遗传改造。本研究着眼于转变传统育种模式，克隆和表达了β蛋白和FLP的编码基因，并进行了纯化酶的重组活性研究，为重组酶的商业开发和拓展其应用奠定了基础。主要研究成果如下：　　(1)按照大肠杆菌碱基偏好性设计βpro基因序列，采用重叠延伸PCR技术，人工合成了编码β蛋白的βpro基因，测序结果与设计100%-致。构建了表达载体pET30a-βpro，转化E.coliBL21(DE3)，优化诱导条件，SDS电泳结果显示一条明显的28kD的特异性融合蛋白，与理论分子量一致。　　(2)为了提高β蛋白的稳定性及可溶性表达量，去除冗余结构，构建了含有1-177个氨基酸残基的β蛋白177表达载体pET30a-βpro177;转化E.coliBL21(DE3)，IPTG诱导表达，SDS电泳结果显示获得β蛋白177的可溶性表达；利用DNA的增色效应，检测了纯化β蛋白177的体外活性，实验结果表明：诱导表达的177个氨基酸残基的β蛋白177具有介导单链DNA退火的活性。　　(3)构建了表达载体pQE32-flp，转化E.coliM15，经诱导表达，SDS电泳结果显示45kD的明显条带，与FLP理论分子量相符：构建了带有FRT位点的卡那霉素表达盒质粒pMD18-FRT-kan-FRT，将纯化的FLP与底物载体pMD18-FRT-kan-FRT反应，琼脂糖凝胶电泳结果显示FLP重组酶具有删除两个同向FRT位点间DNA序列的活性。　　(4)构建了带有不同启动子的flp基因的宽宿主表达载体pBB1MCS-psldh-flp、pBB1MCS-ptufb-flp和pBB1MCS-pgen-flp，转化弱氧化醋酸杆菌，获得阳性转化子；采用两步法RT-PCR验证，结果表明FLP酶在宿主细胞中已转录表达,为FLP酶应用于弱氧化醋酸杆菌的遗传改造奠定基础。

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