新型非病毒基因给药载体聚阳离子脂质体的研究

摘要

基因治疗为遗传性疾病，传染病和癌症等的治疗提供了良好的前景，而研制安全有效的基因传递系统将成为基因治疗成功的最重要因素之一。本课题结合阳离子聚合物和脂质体两种常用的非病毒基因载体的优点，构建了一种新型的聚阳离子脂质体，对其性质、细胞毒性、摄取和体外转染效率进行了探讨，并研究了该载体的细胞摄取机制，细胞摄取动力学、胞内分布以及携载端粒酶抑制剂后的体外细胞药效学。本课题在此研究基础上构建聚阳离子脂质体-鱼精蛋白-DNA复合载体，研究了鱼精蛋白对聚阳离子脂质体转染的促进作用和细胞核的靶向作用。最后考察了聚阳离子脂质体和复合载体介导的IL-12质粒对荷瘤小鼠的抑瘤作用。 本课题首先采用低分子量聚乙烯亚胺和酰氯胆固醇合成了PEI800-Chol，经1H-NMR和红外光谱鉴定，胆固醇分子共价结合到聚乙烯亚胺骨架上。PEI800-Chol分子具有两亲性，亲水端为聚乙烯亚胺骨架，亲脂端是胆固醇分子，荧光探针法测得该化合物的临界胶团浓度为0．1012 mg/ml。这一性质为下一步的脂质体表面修饰提供了有利条件，胆固醇分子能够插入到脂质体双分子层，使得阳离子的聚乙烯亚胺覆盖于脂质体表面，从而使脂质体带正电荷。 本课题以大豆磷脂、胆固醇和PEI800-Chol或DOPE和PEI800-Chol为脂质膜材，采用薄膜分散法制备了两种聚阳离子脂质体（PCLs-S和PCLs-D）。聚阳离子脂质体的平均粒径为133 nm，表面电荷50．1±2．6 mV，具有较强的DNA压缩能力。两种聚阳离子脂质体在N/P大于2时都能结合大部分DNA，而PCLs-S的结合能力大于PCLs-D。PCLs-S的细胞毒性与普通脂质体相当，HeLa细胞的IC50为603．19μg/ml，细胞毒性明显小于商品化试剂LipofectamineTM2000（48μ/ml）。PCLs-S表面的正电荷能够促进HeLa细胞对ODN的摄取，并保护其在细胞内不被降解。与普通脂质体相比，由于表面PEI分子的存在，使得PCLs-S保持了一定的缓冲能力，大大增加了脂质体的内体逃逸能力，有助于提高转染效率。当N/P为10时，PCLs-S/DNA复合物的转染效率最高，与LipofectamineTM2000转染能力相当。与LipofectamineTM2000不同的是在血清存在条件下，PCLs-S的转染效率不受影响，而更高N/P比时，血清的存在增加了绿色荧光蛋白的表达。亲水性的PEI层可能有助于保持复合物在血清中的稳定性，提高转染效率。利用DOPE和PEI800-Chol制备的PCLs-D具有膜融合及“质子泵”缓冲的双重内体逃逸能力，该聚阳离子脂质体介导的绿色荧光蛋白表达率高达68％，显著高于PCLs-S和LipofectamineTM2000（～44％）。 本课题初步研究了聚阳离子脂质体的细胞摄取机制、细胞内的分布和细胞摄取动力学。细胞摄取聚阳离子脂质体的能力和途径与最终的转染效率有一定的联系，而不同细胞株的摄取机制也存在差异。内吞抑制剂氯丙嗪（特异性抑制网格蛋白介导的内吞）作用A549细胞后，能够抑制聚阳离子脂质体的摄取和转染（大于97％），激光扫描共聚焦显微镜观察，FAM标记的ODN集中于细胞周围，PCLs-D/ODN复合物尤为明显，说明A549细胞摄取聚阳离子脂质体以网格蛋白介导的内吞途径占主导。MCF-7细胞的摄取方式相对复杂，除了非网格蛋白介导的内吞途径外还存在一些非能量依赖的内化方式。细胞摄取动力学研究表明，A549细胞对游离ODN、PCLs-S/ODN复合物和PCLs-D/ODN复合物的摄取在4h后趋于稳态，PCLs-S和PCLs-D能够分别提高ODN的细胞摄取速度2．20倍和5．45倍，此外PCLs-D还能降低细胞对ODN的消除，增加ODN在胞内的滞留时间。 基于聚阳离子脂质体理化性质和转染能力的研究，本课题以hTERT为靶点的ASODN为治疗基因，比较了传统阳离子脂质体与聚阳离子脂质体的体外细胞药效学。CLs能够显著增加ASODN的肿瘤细胞抑制作用，ASODN经CLs介导后IC50从153．9μmol/L下降至1．28μmol/L。CLs还能提高ASODN在胞内的稳定性，实现了一次给药后120 h内持续抑制肿瘤细胞的生长。PCLs同样能够提高ASODN的细胞抑制作用，而且细胞毒性更小，更有利于体内给药研究。 质粒DNA进入细胞核是限制基因转染的关键步骤之一，在成功解决载体内体逃逸之后，本课题又对PCLs-D进行了修饰，通过加入鱼精蛋白增加DNA的入核能力，构建聚阳离子脂质体-鱼精蛋白-DNA复合载体。采用“Pre-mixed”和“Post-mixed”两种方法制备的复合载体均显著提高了质粒DNA的转染效率，分别是PCLs-D/DNA复合物转染能力的85倍和12倍，而鱼精蛋白-DNA纳米粒没有转染能力；其他无细胞核靶向能力的阳离子聚合物如壳聚糖和PEI25k经同样方法制备得到的复合载体没有表现出与鱼精蛋白相同的效果，说明鱼精蛋白的细胞核靶向能力对复合载体的转染起了很大的作用，而这一促进作用需要内体逃逸能力为前提条件，激光扫描共聚焦显微术也验证了复合载体传递的基因在细胞内的核靶向能力。鱼精蛋白不仅能增加质粒DNA进入细胞核的数量，经超声破坏实验显示，鱼精蛋白与DNA形成的纳米结构能够很好地保护质粒DNA的完整性，使质粒DNA在细胞内具有长时间转染能力，细胞转染72h后仍有较高水平的基因表达。 经过一系列的体外研究，本课题最后选用IL-12质粒为治疗基因，考察了PCLs-D及其复合载体瘤内直接注射后对荷瘤小鼠的抑瘤效果。结果发现，实验浓度裸IL-12质粒没有抗肿瘤效果，且外周血清中IFN-γ水平较低。经两种载体介导后，均表现出对肿瘤生长的抑制作用，IFN-γ水平也进一步提高。IL-12质粒为5μg时，复合载体组的肿瘤抑制率达到65．8％，为PCLs-D组的两倍。通过PCLs-D和复合载体介导IL-12质粒治疗小鼠腹水肿瘤，在获得高效抑制率的同时也降低了体内直接应用重组IL-12蛋白所带来的副作用。本研究的结果为合理设计非病毒基因载体提供了新方法，也为进一步的体内外研究和应用奠定了一定的基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写、术语表

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致谢

引 言

第一章 聚乙烯亚胺—胆固醇的合成及表征

1 材料与仪器

1.1 材料和试剂

1.2 细胞

1.3 仪器

2 实验方法

2.1 聚乙烯亚胺—胆固醇(PEI 800—Chol)的合成

2.2 核磁共振波谱(1H—NMR)检测

2.3 红外光谱检测

2.4 临界胶团浓度(CMC)测定

2.5 细胞毒性试验

3 结果与讨论

3.1 1H—NMR检测结果

3.2 红外光谱检测结果

3.3 临界胶团浓度

3.4 细胞毒性试验

4 小结

第二章 聚阳离子脂质体的制备、细胞摄取和体外转染

1 材料与仪器

1.1 材料和试剂

1.2 细胞

1.3 质粒

1.4 仪器

2 实验方法

2.1 聚阳离子脂质体(PCLs)和脂质体的制备

2.2 PCLs和脂质体的形态观察

2.3 PCLs缓冲能力的测定

2.4 质粒DNA的提取

2.5 PCLs/DNA复合物的制备

2.6 琼脂糖凝胶电泳

2.7 粒径和电位测定

2.8 PCLs体外细胞毒性实验

2.9 PCLs的细胞摄取研究

2.10 PCLs体外细胞转染

3 结果与讨论

3.1 脂质体和PCLs的形态观察

3.2 PCLs缓冲能力的测定

3.3 琼脂糖凝胶电泳

3.4 PCLs/DNA复合物的粒径和电位

3.5 细胞毒性试验

3.6 PCLs—S对HeLa细胞摄取ODN的影响

3.7 体外细胞转染及血清对转染的影响

3.8 DOPE对PCLs转染的影响

4 小结

第三章 聚阳离子脂质体摄取机制及摄取动力学的初步研究

1 材料与仪器

1.1 材料和试剂

1.2 细胞

1.3 质粒

1.4 仪器

2 实验方法

2.1 氯丙嗪对聚阳离子脂质体摄取的影响

2.2 氯丙嗪及低温对聚阳离子脂质体转染效率的影响

2.3 聚阳离子脂质体细胞摄取动力学

3 结果与讨论

3.1 氯丙嗪对阳离子脂质体摄取的影响

3.2 氯丙嗪及低温对聚阳离子脂质体转染效率的影响

3.3 聚阳离子脂质体细胞摄取动力学

4 小结

第四章 反义寡核苷酸端粒酶抑制剂载体的研究

1 材料与仪器

1.1 材料和试剂

1.2 细胞

1.3 仪器

2 实验方法

2.1 CLs和CLs/ASODN复合物的制备

2.2 CLs外观形态考察和粒径测定

2.3 ASODN对HeLa细胞的抑制作用

2.4 CLs/ASODN复合物对HeLa细胞的抑制作用

2.5 PCLs作为端粒酶抑制剂载体的研究

3 结果与讨论

3.1 CLs的外观形态和粒径分布

3.2 ASODN和CLs/ASODN复合物对HeLa细胞的抑制作用

3.3 CLs/ASODN复合物对HeLa细胞的持续抑制作用

3.4 PCLs作为端粒酶抑制剂载体的研究

4 小结

第五章 聚阳离子脂质体—鱼精蛋白—DNA复合载体的制备及体外转染

1 材料与仪器

1.1 材料和试剂

1.2 细胞

1.3 质粒

1.4 仪器

2 实验方法

2.1 鱼精蛋白/DNA纳米粒的制备

2.2 纳米粒凝胶阻滞电泳和平均粒径测定

2.3 聚阳离子脂质体—鱼精蛋白—DNA复合载体的制备

2.4 复合载体的体外转染

2.5 鱼精蛋白在不同细胞株中对PCLs—D转染效率的影响

2.6 不同阳离子聚合物对PCLs—D转染效率的影响

2.7 鱼精蛋白介导DNA细胞核靶向

2.8 基因表达量随时间变化的研究

3 结果与讨论

3.1 纳米粒凝胶阻滞电泳和粒径

3.2 聚阳离子脂质体—鱼精蛋白—DNA复合载体

3.3 复合载体的体外细胞转染

3.4 鱼精蛋白在不同细胞株中对PCLs—D转染效率的影响

3.5 不同阳离子聚合物对PCLs—D转染效率的影响

3.6 鱼精蛋白介导DNA细胞核靶向

3.7 基因表达量随时间变化的研究

4 小结

第六章 聚阳离子脂质体及复合载体介导白介素—12 质粒的抗肿瘤实验研究

1 材料与仪器

1.1 材料和试剂

1.2 细胞

1.3 质粒

1.4 动物

1.5 仪器

2 实验方法

2.1 ICR小鼠肿瘤造模

2.2 pCMV—IL—12 的抗肿瘤研究

2.3 聚阳离子脂质体及复合载体介导pCMV—IL—12 的抗肿瘤研究

2.4 ELISA测定荷瘤小鼠外周血中IFN—γ水平

3 结果与讨论

3.1 pCMV—IL—12 的抗肿瘤作用

3.2 聚阳离子脂质体及复合载体介导pCMV—IL—12 的抗肿瘤作用

3.3 荷瘤小鼠外周血中IFN—γ水平

4 小结

全文总结

参考文献

综 述：PEI及其衍生物在非病毒基因载体中的应用

作者简历