副溶血弧菌分子检测靶点的筛选及其内标PCR体系的建立

摘要

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是引起食源性疾病的一种重要致病菌,它常污染海产品如蟹、牡蛎、虾、贝等,从而引起食物中毒。中国国家食源性疾病监控网络数据显示,近年来沿海地区副溶血弧菌感染事件和人数呈明显上升趋势,甚至超过沙门氏菌跃居首位,因此,建立快速、灵敏的副溶血弧菌检测方法对于食品安全监控具有重要意义。以分子生物学为基础发展起来的聚合酶链式反应(PCR)技术,凭借其灵敏度高、特异性强、检测速度快等优势,在副溶血弧菌的快速检测中具有广阔的应用前景。但是,目前文献报道的副溶血弧菌检测靶点不仅数量有限,且特异性不强,易造成假性结果。此外,抑制成分的存在也会干扰PCR扩增反应,出现假阴性检测结果。因此,为有效提高PCR检测方法的准确率,发掘新的检测靶点,并在PCR反应体系中加入指示假阴性的扩增内标是非常必要的。本研究致力于发掘新的检测靶点,并与人工构建的扩增内标相结合,建立水产品等食品中副溶血弧菌新的PCR检测体系,研究内容主要包括以下三个方面：一、副溶血弧菌种特异检测靶点的筛选及其验证本研究通过在线BLAST比对以及PCR评价等方法从61个候选靶点中筛选出一个特异强、灵敏度高的检测靶点(vp1332),并基于该靶点建立了两种PCR检测体系,即添加有扩增内标的副溶血弧菌常规PCR检测体系与添加有扩增内标的荧光定量PCR检测体系。二、建立添加有扩增内标的副溶血弧菌常规PCR检测体系1)扩增内标的构建：在副溶血弧菌基因组中选取一段与目的基因(vp1332)同源性很低的序列,采用复合引物的方法构建扩增内标；2)PCR反应体系的优化：经过优化后,选择退火温度为58oC、Mg2+浓度为1.5 mmoL/mL以及扩增内标添加量为4.29×103拷贝/PCR,来建立副溶血弧菌常规PCR检测体系；3)特异性的评价：对309株副溶血弧菌和81株非副溶血弧菌进行PCR检测,结果显示,所有副溶血弧菌基因组DNA模板均可扩增到一条343 bp的目的条带,而以非副溶血弧菌DNA为模板则只能扩增到一条499 bp的扩增内标条带；4)灵敏度的评价：当扩增内标的添加量为4.29×103拷贝/PCR时,基因组DNA的检测灵敏度可达30.0 fg/μL,纯培养物的检测灵敏度为1.6×102 cfu/mL。当25 g无菌虾肉中人工污染有1.24 cfu的副溶血弧菌时,经过8 h的增菌培养即可得到阳性检测结果,整个检测过程能在12 h内完成；5)抗干扰能力的评价：当干扰菌浓度达109 cfu/mL并一起增菌12 h后或者当干扰菌基因组DNA的总添加量达21.5 ng/PCR时,均能检测到副溶血弧菌；6)准确度的评价：对7种(106份)食品样品进行检测,能够从中准确地检测出副溶血弧菌,同时,也能有效地指示假阴性。三、添加扩增内标的副溶血弧菌荧光定量PCR检测体系的建立1)扩增内标的构建：用复合引物的方法构建扩增内标,并设计相应的探针；2)PCR反应体系的优化：经过优化后,选择目的探针添加浓度为300 nM、扩增内标探针添加浓度为200 nM、扩增内标添加量为94拷贝/PCR,来建立副溶血弧菌荧光定量PCR检测体系；3)特异性的评价：对309株副溶血弧菌和81株非副溶血弧菌进行PCR检测,结果显示,所有副溶血弧菌的基因组DNA中均能采集到目的探针信号,而非副溶血弧菌基因组DNA中则只能收集到内标探针信号；4)灵敏度的评价：当扩增内标的添加量为94拷贝/PCR时,纯基因组DNA检测灵敏度可达2.4 fg/μL,纯培养物的检测灵敏度为1 cfu/PCR；5)抗干扰能力的评价：当干扰菌基因组DNA的总添加量为2.1μg或者干扰菌总量为107 cfu/mL(未增菌)时,均能检测到副溶血弧菌；6)准确度的评价：对7种(96份)食品进行副溶血弧菌检测时,能够从中准确地检测出副溶血弧菌,同时,也能有效地指示假阴性结果。本研究建立的副溶血弧菌内标PCR检测体系,能成功排除假阴性检测结果,整个检测过程快速、准确、特异、灵敏,有望成为副溶血弧菌法定检测方法,并应用于食品中副溶血弧菌的快速检测。

目录

摘要

ABSTRACT

英文缩略语索引

第一章 绪论

1 副溶血弧菌的主要特征

2 副溶血弧菌检测方法研究现状

2.1 传统培养方法

2.2 KP 溶血试验

2.3 免疫学方法

2.4 核酸杂交

2.5 乳胶凝集试验

2.6 PCR 法

2.7 基因芯片技术

3 PCR 方法检测副溶血弧菌的靶基因及其优缺点

4 荧光定量 PCR 的原理和分类

4.1 原理

4.2 分类

4.3 存在的缺点

5 扩增内标的研究概况

5.1 扩增内标的构建方法

5.2 扩增内标在食源性致病菌PCR 检测体系中的应用

6 研究的目的与意义

第二章 副溶血弧菌特异性检测靶点的筛选及其验证

1 材料

1.1 菌种

1.2 培养基及主要试剂的配制

1.3 仪器和设备

2 方法

2.1 细菌的培养及基因组DNA 的提取

2.2 副溶血弧菌特异检测靶点的筛选及引物设计

2.3 PCR 反应条件的优化

2.4 特异性评价

2.5 灵敏度评价

2.6 抗干扰能力的评价

3 结果

3.1 副溶血弧菌特异检测靶点的筛选及引物设计

3.2 PCR 反应体系的优化

3.3 特异性评价

3.4 灵敏度评价

3.5 抗干扰能力评价

4 讨论

第三章 含有扩增内标的副溶血弧菌常规PCR 检测方法的建立

1 材料

1.1 菌种和质粒

1.2 培养基

1.3 主要试剂配方

1.4 仪器和设备

2 实验方法

2.1 扩增内标的构建

2.2 扩增内标添加量的选择试验

2.3 特异性评价

2.4 人工污染试验

2.5 食品样品检测试验

3 结果

3.1 扩增内标的构建

3.2 扩增内标添加量的选择试验

3.3 特异性评价

3.4 人工污染试验

3.5 食品样品检测试验

第四章 含有扩增内标的副溶血弧菌TaqMan 荧光定量PCR 检测方法的建立

1 材料

1.1 菌种

1.2 培养基

1.3 主要试剂

1.4 主要仪器设备

2 实验方法

2.1 引物和探针的设计

2.2 扩增内标的构建

2.3 含有扩增内标的荧光定量 PCR 反应体系的优化

2.4 特异性评价

2.5 灵敏度评价

2.6 抗干扰能力评价

2.7 人工污染试验

2.8 食品样品检测试验

3 结果

3.1 引物和探针的设计

3.2 含有扩增内标的荧光定量 PCR 反应体系的优化

3.3 特异性评价

3.4 灵敏度评价

3.5 抗干扰能力评价

3.6 人工污染试验

3.7 自然污染食品样品中副溶血弧菌的检测

4 讨论

第五章 总结与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

上海交通大学学位论文答辩决议书