泛素连接酶Hrd1介导神经细胞内过度磷酸化tau蛋白降解

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种最常见的神经退行性疾病,tau蛋白异常过度磷酸化形成的神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFTs)是其主要病理特征之一,在AD的发病中起举足轻重的作用。定位于内质网膜上的泛素连接酶Hrd1能够通过泛素-蛋白酶体通路介导多种异常聚集蛋白质的降解。前期研究发现 Hrd1和 tau蛋白在神经细胞中存在着广泛的共定位,据此推测Hrd1可能会介导过度磷酸化tau蛋白的降解。本研究通过在神经细胞中过度表达或沉默内源性Hrd1的表达,观察神经细胞中过度磷酸化tau蛋白的水平变化,以了解Hrd1是否影响磷酸化tau蛋白的降解。
　　目的:
　　观察Hrd1是否可以促进神经细胞中过度磷酸化tau蛋白的降解,并了解生理性的Hrd1是否对神经元有保护。
　　方法:
　　通过免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)和蛋白质片段互补实验(Protein Complementation Assay,PCA)证明 Hrd1和tau蛋白之间存在相互作用;在N2A细胞中过表达Hrd1和tau蛋白,观察 Hrd1是否促进tau蛋白的降解;将GSK-3β转染神经细胞及用OA诱导tau过度磷酸化,观察Hrd1是否促进磷酸化tau蛋白的降解;用siRNA沉默内源性Hrd1的表达,观察细胞过度磷酸化tau蛋白的聚集情况,同时观察内源性Hrd1是否对神经细胞有保护作用。
　　结果:
　　1.Hrd1与tau蛋白之间相互作用
　　1.1免疫共沉淀在293T细胞中共转染tau质粒和Hrd1-his/myc(野生型),Hrd1C1A-his/myc(功能失活型)或Vector,转染24 hrs后提取细胞裂解上清液,用Protein A beads和anti-myc抗体免疫沉淀Hrd1,IB检测免疫沉淀物发现Hrd1-his/myc和Hrd1C1A-his/myc组均有tau蛋白存在,证明Hrd1和tau蛋白存在着相互结合作用,且为RING finger domain功能非依赖性。
　　1.2蛋白质互补实验构建含荧光素酶(Luciferase)报告基因的Hrd1和tau的真核表达质粒,共转染293T细胞24 hrs后提取细胞裂解上清液,检测荧光素酶活性。Hrd1-hGluc(1)+hGluc(2)-tau组显示出极强的荧光素酶活性,说明 Hrd1和tau蛋白在293T细胞浆中结合,使报告基因荧光素酶的两个劈裂单元结合,产生催化荧光素底物的活性。
　　2.Hrd1促进N2A细胞中外源性过度表达的tau蛋白的降解
　　在 N2A细胞中过度表达Hrd1、Hrd1C1A、Vector和 tau,另设一组平行转染GSK-3β诱导tau蛋白发生过度磷酸化,观察各组中tau蛋白水平。发现Hrd1能够明显促进外源性过表达 tau蛋白的降解,且此功能为RING finger domain功能依赖性的。
　　3.Hrd1促进OA诱导的N2A细胞中内源性过度磷酸化的tau蛋白降解
　　在N2A细胞中分别转染Hrd1、Hrd1C1A和Vector,再以OA诱导其内源性tau蛋白过度磷酸化,用AT-8单克隆抗体检测磷酸化tau蛋白,发现Hrd1组,OA诱导的磷酸化tau蛋白水平比Hrd1C1A和Vector组明显减少。
　　4.Hrd1加快N2A细胞中过表达外源性tau蛋白的降解速率
　　在N2A细胞中分别转染Hrd1、Hrd1C1A、Vector和tau,转染24 hrs后加入放线菌酮(CHX)抑制蛋白质的合成,分别于0,8,16 h收取细胞,观察tau蛋白水平的下降速率。发现Hrd1组tau蛋白降解速率明显加快。
　　5.Hrd1 knockdown并验证
　　应用RNAi技术对N2A细胞中进行Hrd1knockdown,转染siRNA后24 hrs提取总RNA进行RT-PCR,同时留取Trizol裂解液蛋白相提取蛋白检测蛋白质水平变化。结果显示第3条siRNA沉默有效,同时检测蛋白质水平也有下降,遂选取此条siRNA进行后续实验。
　　6.Hrd1 knockdown抑制OA诱导的内源性过度磷酸化tau蛋白的降解速率
　　应用验证有效的siRNA转染N2A细胞24hrs以后,加入 OA处理,再给予CHX,观察Hrd1 knockdown以后,内源性过度磷酸化tau蛋白下降速率的变化情况,结果发现siRNA组高度磷酸化tau蛋白水平维持稳定,且随着时间延长,有高分子量的聚集体出现,这与阿尔茨海默病发病机制中tau蛋白过度磷酸化后易于形成神经原纤维缠结相一致。
　　7.原代胎鼠皮层神经元培养及染色鉴定
　　取孕18 d胎鼠皮层组织消化后,吹打制成单细胞悬液接种到24孔板,培养液为含10 nmol·L-1阿糖胞苷的Neurobasal Medium(临用时1:50加入B27),每3d换液一次,至第9d进行免疫荧光染色鉴定,结果显示,胎鼠皮层神经元培养成功,纯度较高。
　　8.Hrd1 knockdown导致OA处理的原代培养胎鼠皮层神经元轴突破坏加重
　　对上述培养的原代胎鼠皮层神经元进行Hrd1 knockdown后,加入 OA诱导tau蛋白过度磷酸化,对神经元进行形态学观察,与对照组比较发现,Hrd1 knockdown组神经元轴突结构破坏明显加剧,细胞死亡增多。
　　结论:
　　Hrd1能够与tau蛋白相互作用,从而介导神经细胞内过度磷酸化tau蛋白的降解,减轻其对神经细胞的毒性作用,这种作用是RING finger依赖的。

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中文摘要

英文摘要

1前言

2 实验材料

2.1 实验动物

2.2 细胞株、菌株及质粒

2.3 抗体

2.4 主要试剂来源及配制

2.5 引物及siRNA

2.6 实验仪器

3 实验方法

3.1 重组质粒的构建及质粒提取

3.2 细胞培养及转染

3.3 免疫印迹（Immunoblotting，IB）

3.4 RT-PCR

3.5 免疫共沉淀

3.6 蛋白质互补实验

3.7 CHX示踪实验

3.8 细胞免疫荧光染色

3.9 细胞活力测定(MTT)

4结果

4.1 Hrd1与tau蛋白之间的相互作用

4.2 Hrd1降低过度表达的tau蛋白的水平

4.3 Hrd1降低过度磷酸化tau的水平

4.4 Hrd1促进过表达的外源性tau蛋白的降解

4.5 Hrd1促进内源性过度磷酸化tau蛋白降解

4.6 Hrd1-siRNA的设计和验证

4.7 Hrd1-siRNA抑制内源性过度磷酸化tau蛋白的降解

4.8 Hrd1-siRNA对细胞活力的影响

4.9 原代皮层神经元培养及鉴定

5讨论

5.1 tau蛋白磷酸化与阿尔茨海默病

5.2 Hrd1与tau蛋白之间存在相互作用

5.3 Hrd1促进过度磷酸化tau蛋白降解

6 结论

7 本研究的创新点

参考文献

附录

硕士期间发表的论文

致谢

综述