泛素连接酶Hrd1介导的tau蛋白降解

摘要

神经细胞中的tau蛋白异常聚集是许多神经退行性疾病共有的病理特征，例如在阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，进行性核上瘫(progressivesupranuclear palsy)及第17号染色体异常导致的额颞叶型痴呆伴巴金森症(frontotemporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17，FTDP-17)，这些疾病统称为tau蛋白病(tauopathy)。我们的前期研究发现，人类的泛素连接酶Hrd1和tau在AD病人的皮质和海马神经元内有共定位。且Hrd1的表达和异常磷酸化tau的聚集存在负相关。我们在细胞模型上观察到Hrd1的表达可以减少tau的毒性，并发现该作用与Hrd1能降低tau蛋白总体水平有关。在上述研究的基础上，本文进一步探讨了Hrd1减少细胞内tau蛋白水平的相关机制。这不仅有助于进一步认识Hrd1的功能和tau蛋白病的病理机制，也为以Hrd1为靶点的药物设计和筛选提供技术平台。 目的：观察Hrd1能减少细胞内tau蛋白水平是否与其介导tau降解有关及其降解机制。 方法：将pEGFP-C1-tau真核细胞表达质粒与野生型。Hrd1或酶失活型Hrd1C1A转染293T细胞，然后用Western blot方法检测细胞内相关蛋白的水平；同时用GSK-3 β诱导tau过度磷酸化，观察Hrd1过度磷酸化的tau降解的影响。用CHX示踪法观察蛋白质的降解；用免疫荧光双标及免疫沉淀法观察Hrd1和tau的相互作用。 结果： 1.Hrd1降低细胞内磷酸化及非磷酸化tau的水平采用非神经来源的293T细胞株，转染GFP-tau、wtHrd1和Hrd1C1A质粒，并用GSK-3 β共转染细胞以诱导tau蛋白磷酸化。结果显示，转染后16-24 h，共转染Hrd1的细胞荧光减弱。Western blot结果显示：与单独转染tau质粒的细胞相比，共转染Hrd1的细胞内磷酸化及非磷酸化tau的水平都明显减少，而共转染Hrd1C1A则对细胞内tau的水平没有明显影响。提示，Hrd1能降低细胞内磷酸化及非磷酸化tau的总体水平，这可能是Hrd1减少tau毒性的病因。 2.Hrd1促进tau蛋白的降解为了进一步观察tau蛋白的减少是否由于tau降解增加所致，我们在转染后24 h，在细胞的培养上清液中加入放线菌酮(CHX)以阻断tau的蛋白合成，并于加入CHX后4 h，8 h，16 h分别收取细胞，用免疫印记分析tau的水平。结果显示共转染Hrd1的细胞，tau蛋白的清除加快。表明Hrd1可以促进tau的降解。 3.Hrd1促进磷酸化tau蛋白的降解年龄相关的NFTs的形成具有神经毒性，高度磷酸化的tau在这个过程中具有重要作用。以前的研究表明泛素连接酶CHIP可以识别磷酸化的tau蛋白，并且在tau蛋白上加上泛素。我们在293T细胞中共转染编码tau和GSK-3 β的质粒来诱导tau的磷酸化。结果发现GSK-3 β磷酸化后tau蛋白的总体水平提高。这个可能由于tau磷酸化后稳定性提高的缘故。当共转染Hrd1时，Hrd1降低了GSK-3 β诱导的磷酸化tau的总量。CHX实验表明wtHrd1可以促进磷酸化tau蛋白的降解。这些结果表明Hrd1可以促进磷酸化tau蛋白的降解。 4.蛋白酶体参与Hrd1介导的tau降解有报道显示，蛋白酶体可以降解tau蛋白。为了观察蛋白酶体是否参与了Hrd1介导的tau蛋白降解，我们在293T细胞内转染tau或共转染tau和Hrd1，在收取细胞前4 h，培养液内加入蛋白酶体抑制剂MGl32或溶酶体抑制剂氯化铵。结果表明，蛋白酶体抑制剂MG132可以稳定tau蛋白的表达，而氯化铵不能稳定tau的表达。当用N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)抑制去泛素化后，我们可以观察到高分子量tau的聚集，这些结果表明蛋白酶体参与了Hrd1介导的tau蛋白的降解。 5.Hrd1与tau蛋白的相互作用我们以前的研究发现，Hrd1可加强胞质蛋白带有扩展型多聚谷氨酰胺Huntingtin的降解。Hrd1是否也可以与胞质蛋白tau相互作用呢?为了回答这个问题，我们首先进行了免疫共沉淀(IP)实验。在293T细胞内共转染tau和Hrd1的质粒，24h后收集细胞并裂解，然后用单克隆抗体tau-5进行免疫沉淀细胞裂解液中的tau蛋白，再用免疫印迹(IB)法检测Hrd1是否可以被tau共沉淀下来。结果发现，在IP tau时，同时把Hrd1共沉淀下来，而且这种作用是不依赖于Hrd1的E3活性的。同时，我们使用免疫荧光双标时发现，Hrd1与tau在细胞内有共定位。提示Hrd1与tau蛋白存在相互作用。 6.Hrd1增强tau的泛素化为了更进一步确定Hrd1可以泛素化tau蛋白，我们在293T细胞内共转染编码Hrd1，His-tau，ubiquitin蛋白的质粒。蛋白酶体抑制剂MG132用来抑制泛素化tau的降解。我们发现Hrd1的过表达可以增加高分子量的tau，当用GFP-tau质粒转染细胞时，也得到了同样的结果。在免疫沉淀实验中，抑制蛋白酶体活性后，转染Hrd1质粒的细胞tau的泛素化明显增强。这些高分子量tau的形成与tau的泛素化有关。为了了解tau磷酸化对Hrd1介导的tau泛素化的影响，我们在293T细胞内共转染编码GSK-3 β的质粒。结果发现，在共转染GSK-3 β的细胞内，高分子量tau蛋白的量显著增加，提示GSK-3 β诱导的磷酸化可以稳定泛素化的tau蛋白。结论： 以上研究结果表明，Hrd1可以促进细胞内过度表达的磷酸化和非磷酸化tau的降解，这种作用依赖其E3活性；泛素-蛋白酶体通路参与了Hrd1介导的tau蛋白降解，这可能是Hrd1减轻tau毒性，保护细胞的原因之一。

目录

论文说明：英文缩略词表(Abbreviation)

声明

1.前言

2.实验材料

3.方法

4.结果

5.讨论

6.小结

7.本研究的创新点

8.参考文献

个人简历

致谢

综述：泛素-蛋白酶体通路在AD中的作用