应用Bac-to-Bac杆状病毒表达体系在sf9细胞中重组表达保守性多巴胺能神经营养因子

摘要

目的:应用bac-to-bac杆状病毒表达体系在sf9昆虫细胞中表达重组CDNF蛋白。
　　方法:应用Trizol法提取小鼠组织总RNA,RT-PCR扩增得到小鼠CDNF基因全长(564bp)片段,将CDNF基因插入至转座载体pFastBacHTb中,构建重组质粒pFastBacHTb-CDNF,然后转化到E.coli DH5α感受态细胞中,以LB/Amp平板筛选阳性重组子,并经 PCR、酶切及测序验证以保证重组载体的正确及可靠性;将杆状病毒转移载体pFasBacHTb-CDNF转化到DH10Bac E.coli(自带杆粒及辅助质粒)感受态细胞中,通过转座作用将目的片段整合到杆粒中,抗性及蓝白斑筛选法筛选出重组杆状病毒载体 Bacmid-CDNF,使用 CDNF特异引物及PUC/M13杆粒测序引物对重组杆粒进行验证;参照CELLFECTINⅡ脂质体转染剂操作说明,将重组Bacmid-CDNF杆粒转染sf9昆虫细胞,并在光学显微镜下观察细胞形态学变化,以判断转染的成功性;转染成功后,收集P1代病毒液,继续感染sf9细胞,可获取P2代和P3代病毒液,应用P3代病毒诱导重组CDNF蛋白的表达,并应用Western blot对重组蛋白的表达进行验证。
　　结果:(1)RT-PCR结果经琼脂糖凝胶电泳显示,成功获取564bp大小的CDNF目的基因片段,重组质粒 pFastBacHTb-CDNF经PCR、酶切及基因测序验证均正确无误;(2)重组转移载体pFastBacHTb-CDNF转化DH10Bac感受态细胞后,阳性bacmid-CDNF重组子经CDNF特异引物及pUC/M13杆粒测序引物PCR验证可分别获取561bp及3000bp大小目的片段,均与理论大小相符,表明杆粒构建成功;(3)重组杆粒通过Cellfectin转染剂转染sf9昆虫细胞,转染48~72后,sf9细胞细胞直径逐渐增大,细胞渐脱离贴壁培养状态,随之,细胞渐渐肿胀,种种迹象均表明,杆粒转染成功,收获杆状病毒液;(4)P3代杆状病毒液感染sf9细胞,诱导重组CDNF蛋白表达,经Western blot验证,目的蛋白成功诱导表达,并符合预计大小(21KD)。
　　结论:通过bac-to-bac杆状病毒表达系统成功诱导CDNF重组蛋白的表达。

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主要缩略词

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前言

第一部分CDNF杆状病毒转移载体的构建与鉴定

1材料与方法

1.1材料

1.2 方法

1.3 结果

1.4 结论

1.5 讨论

参考文献

第二部分CNDF重组杆状病毒表达载体的构建及重组CDNF蛋白在sf9细胞中的表达及鉴定

1.材料与方法

1.1材料

1.2 方法

1.3 结果

1.4 结论

1.5 讨论

参考文献

第三部分pDsRed2-C1-CDNF真核表达载体的构建及其在大鼠MSCs原代细胞中的表达

1.材料及方法

1.1 材料

1.2 方法

1.3 结果

1.4结论

1.5讨论

参考文献

附录

致谢

综述