DNA修复基因单核苷酸多态性和食管癌易感性及放疗后损伤和生存关系的研究

摘要

我国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家，在中国十大恶性肿瘤死亡率中，食管癌死亡率居第四位。我国90％以上为鳞状细胞癌。放射性治疗是食管癌的主要治疗手段之一，但食管癌预后差，中晚期患者治疗后5年生存率不足20％。虽然研究表明吸烟、饮酒过度、肥胖和营养缺乏都可能引起食管癌，然而，即使暴露于相同环境因素的人群中也只有少部分个体罹患食管癌。另外，临床中也常常发现即便是相同的病理类型和分期的患者接受相同的治疗方案后，其治疗后副作用及生存率均存在巨大的差异。上述情况提示个体的遗传因素可能在食管癌易感性、治疗效果和预后等方面起着重要的作用。　　内在因素或外在环境因素中各类理化、生物致癌因子均可对细胞DNA造成损伤，以致引起DNA结构和序列的改变，增加增殖性细胞的基因组不稳定性。在人体细胞内，DNA损伤可以通过DNA损伤修复系统来修复，修复能力的不足可以增加个体罹患食管癌的危险度，影响治疗效果和预后。目前认为，不同个体DNA修复能力的差异是由遗传决定的，可能是DNA修复通路中某些核心基因的多个功能性单核苷酸多态性(SNP)的综合作用引起的。　　目前关于DNA修复基因单核苷酸多态性和食管癌易感性、治疗效果和预后关系的研究体现了以下几个方面的特点:1）样本量小(＜1000例)，统计学分析把握度不够，结果重复性差;2）较少考虑基因-环境交互作用;3）用来阐明基因多态性可能的生物学机制的功能学研究匮乏;4）临床转化研究较少。　　基于以上认识，我们的研究以＞1000例中国汉族人群食管鳞癌患者和＞1000例与之匹配的无肿瘤病史的正常人为研究对象，采用以医院为基础的病例-对照研究方法、候选基因和功能性位点为主的SNP选择策略，筛选了DNA修复通路中6个代表性基因(XPC，ERCC2，ERCC5，FEN1，hOGG1和NEIL1)的12个功能性SNP位点，Taqman基因型检测技术，探讨DNA修复基因SNP与食管癌发病风险之间的关系及可能存在的基因-环境交互作用。并在此基础上，通过检测细胞和癌旁组织中不同基因型相关的mRNA表达水平，从体内外水平探寻DNA修复基因功能性SNP可能的生物学机制。最后，在187例仅接受根治性放疗或放化疗的食管鳞癌患者中，采用病例-病例研究方法，用Taqman基因型检测技术对DNA修复通路中6个候选基因(XRCC1，FEN1，hOGG1，NEIL1，RAD51和WRN)的12个功能性SNP进行基因型分型，探讨DNA修复基因SNP位点与食管癌放疗后急性放射性肺炎、急性放射性食管炎和总生存期的关系。　　本研究为揭示DNA修复基因SNP和食管癌易感性及可能的生物学机制提供理论依据，也为今后食管癌的个体化预防和诊治提供重要参考。　　第一部分 DNA修复基因单核苷酸多态性和食管癌易感性的关联研究及功能探讨　　目的:DNA修复基因在食管癌的发生过程中起着重要的作用，其功能性SNP位点可能通过改变DNA损伤修复的能力而影响个体罹患食管癌的易感性。我们对DNA修复基因功能性SNP位点进行分析，探寻它们与食管癌易感性的关系，同时探讨其可能的生物学机制。　　材料与方法:我们以1126例食管鳞癌患者和1131例年龄、性别匹配的健康对照为研究对象，采用以医院为基础的病例-对照研究方法，候选基因和功能性位点为主的SNP选择策略筛选了6个DNA修复基因(XPC，ERCC2，ERCC5，FEN1，hOGG1和NEIL1)的12个功能性SNP位点，采用Taqman法进行基因型分型，多元Logistic回归模型和多因素降维(MDR)分析不同基因型的主效应、联合效应和环境-基因交互作用，同时用假阳性报告率(FPRP)检验真实的关联。在此基础上，我们在125例食管鳞癌癌旁组织标本中检测基因型相关的mRNA表达水平;同时从数据库中下载了来源于4个种族270名正常人的基因型数据和相对应的B淋巴母细胞系中基因mRNA表达水平，通过线性回归模型趋势检验评估不同人群SNP基因型对mRNA表达水平的影响。　　结果:在单个位点分析中，3个基因的3个SNP位点与食管鳞癌的发生显著相关，分别是ERCC2 rs238406、ERCC5 rs2296147和FEN1 rs4246215。在危险型基因型联合分析中，食管鳞癌的发病风险随着ERCC2、ERCC5危险型基因型的数目增加而增加，呈现很好的剂量-反应效应(Ptrend=0.007)。在分层分析中，ERCC2rs238406 TG/TT基因型携带者较GG基因型携带者，ERCC2≥1个危险型基因型携带者较未携带危险型基因型者，均显著提高累计吸烟剂量＞16包年的个体食管鳞癌发病风险，都达到了1.58倍，且同质性检验发现层间差异达到统计学显著性(P=0.036和P=0.050)。多元Logistic回归模型和多因素降维(MDR)一致发现ERCC2rs238406变异基因型与累计吸烟剂量之间存在交互作用(P=0.018)。假阳性报告率(FPRP)检验证实上述关联是可信的。线性回归模型趋势检验发现在B淋巴母细胞系中，ERCC2 rs238406等位基因G→T的改变影响ERCC2 mRNA表达水平，其趋势在亚洲人群中达到统计学临界值(Ptrend=0.098)，在欧洲人群中达到统计学显著性(Ptrend=0.011)，但在中国汉族人群中无统计学意义(Ptrend=0.960)，其它与食管癌易感性相关的SNP位点对mRNA表达水平均无影响。　　结论:本研究是目前为数不多的探索DNA修复基因功能性SNP与食管癌易感性关联性的大样本病例-对照研究。结果进一步支持DNA修复基因的遗传变异与食管癌的发病风险相关，还需要更大的样本及进一步功能学研究去验证。　　第二部分 DNA修复基因单核苷酸多态性和食管癌放疗后损伤及生存关系研究　　第一节 DNA修复基因单核苷酸多态性和食管癌放疗后损伤的相关性研究　　目的:DNA修复基因在辐射造成的DNA损伤修复中起着重要作用，其功能性SNP位点可能通过改变DNA损伤修复的能力而影响患者对放疗的反应性。我们对DNA修复基因功能性SNP位点进行了分型，探寻DNA修复基因SNP位点与食管癌放疗后急性放射性肺炎和急性放射性食管炎发生之间的相关性。　　材料与方法:我们选择于2008年1月～2011年12月期间在复旦大学附属肿瘤医院进行根治性放疗或放化疗的食管鳞癌患者。从DNA修复基因中选择6个基因(XRCC1、hOGG1、FEN1、NEIL1、RAD51和WRN)的12个功能性SNP位点。治疗前留取外周血标本，Taqman方法进行基因型分型。放射治疗中及治疗后评价急性放射性肺炎和食管炎发生情况(评价标准为CTCAE v4.0)，评价终点为≥2级急性放射性肺炎和≥2级急性放射性食管炎。采用Cox危害风险回归模型进行相关性的单因素和多因素分析，计算危害风险比及95％可信区间。　　结果:共入选187例符合标准的食管鳞癌患者，其中男性138例，女性49例，中位年龄64岁。急性放射性肺炎和急性放射性食管炎发生的中位时间分别是放疗开始后的第35天和第24天，共有28例患者(15.0％)发生了≥2级急性放射性肺炎，42例患者(22.5％)发生了≥2级急性放射性食管炎。V20被发现和≥2级急性放射性肺炎相关，年龄和LE50被发现和≥2级急性放射性食管炎相关。携带有NEIL1rs4462560 GC/CC基因型的患者较GG基因型的携带者发生≥2级急性放射性肺炎的危害风险减低(校正后HR=0.39，95％ CI=0.16-0.95，P=0.037)。同样的相关性也发生在≥2级急性放射性食管炎中(校正后HR=0.42，95％ CI=0.21-0.86，P=0.017)。　　结论:NELL1基因的功能性SNP位点可能是食管癌放疗后急性放射性肺炎和急性放射性食管炎发生的独立预测因素，该结果需要更大的样本及功能学研究中去验证。　　第二节 DNA修复基因单核苷酸多态性和食管癌放疗后生存的相关性研究　　目的:DNA修复基因功能性SNP位点可能通过改变DNA损伤修复的能力而影响食管癌患者放疗后生存情况。我们对DNA损伤修复基因功能性SNP位点进行分型，探寻DNA修复基因SNP位点与食管癌放疗后总生存期之间的相关性。　　材料与方法:我们选择187例于2008年1月～2011年12月期间在复旦大学附属肿瘤医院进行根治性放疗或放化疗的食管鳞癌患者。用Taqman方法对DNA修复通路中6个基因(XRCC1、hOGG1、FEN1、NEIL1、RAD51和WRN)12个功能性SNP位点进行基因型分型。评价终点为总生存期。采用Kaplan-Meier法进行基因型与总生存期相关性的单因素分析，用Log-rank法检验两组生存曲线差异是否有统计意义。采用Cox危害风险回归模型进行相关性多因素分析。　　结果:生存随访截止时间是2013年1月，97例患者(55.1％)死亡，中位生存期为11个月，79例患者(44.9％)存活，中位生存期为27个月。1-，2-和-3年的总生存期分别是70.5，49.9和43.4％。肿瘤TNM分期和LGTV-P被发现和总生存期相关。携带WRN rs2725335 GA/GG基因型的患者较AA基因型携带者延长总生存期(校正后HR=0.43，95％ CI=0.22-0.86，P=0.017)。携带HOGG1 rs1052133 CC基因型的患者较GG基因型携带者缩短总生存期，其相关性达到统计学临界值(校正后HR=1.79,95％ CI=0.98-3.27, P=0.057)。　　结论:WRN基因的功能性SNP位点可能是食管癌放疗后生存的独立预测因素，该结果需要在更大的样本及功能学研究中去验证。

目录

摘要

引言

第一部分 DNA修复基因单核苷酸多态性和食管癌易感性的关联研究及功能探讨

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 DNA修复基因单核苷酸多态性和食管癌放疗后损伤及生存关系的研究

序言

第一节 DNA修复基因单核苷酸多态性与食管癌放疗后损伤的相关性研究

前言

材料与方法

结果

讨论

第二节 DNA修复基因单核苷酸多态性与食管癌放疗后生存的相关性研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

总结

附录一：主要缩略词中英文对照(按字母序排列)

附录二：综述 DNA损伤修复基因单核苷酸多态性与食管癌易感性的研究进展

附录三：攻读学位期间发表文章情况

致谢

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