乙型肝炎病毒X蛋白拮抗α干扰素抗病毒活性机理的初步研究

摘要

目的：探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对α干扰素(IFN-α)诱导的抗病毒蛋白的影响及相关作用机理。
　　方法：将未处理的肝胚瘤细胞株 HepG2细胞作为空白组;将转染空载体质粒pcDNA3.1(-)的HepG2细胞作为空载体组;将转染HBx蛋白表达质粒FL1-145HBx的HepG2细胞作为转染组;预处理组是将细胞转染质粒FL1-145HBx6小时后,再以细胞外调节蛋白激酶途径(ERK途径)抑制剂(PD98059,以DMEM培养液配制成40μmol/L)处理细胞12小时。各组细胞以1,000IU/ml的IFN-α作用6小时后,用Western blot方法检测各种相关蛋白的表达;以RT-PCR法分析IFN-α抗病毒蛋白MxA、STAT1的mRNA水平。
　　以稳定转染HBV全基因组,能够分泌完整HBV病毒颗粒子的肝胚瘤细胞株HepG2.2.15细胞作为细胞模型,进行质粒 pcDNA3.1-Flag-MxA转染,并应用1,000IU/ml的IFN-α处理,Western blot检测细胞内MxA蛋白的表达,ELISA方法检测HepG2.2.15细胞分泌的HBV HBsAg和HBeAg量。
　　结果：研究发现:转染HBx重组质粒的HepG2细胞能够表达HBx蛋白;转染组细胞经IFN-α诱导处理后,STAT1蛋白磷酸化水平(p-STAT1)、STAT1蛋白表达总量(t-STAT1)以及STAT1 mRNA水平与空载体组和未转染组相比显著减少(P<0.05),而经ERK抑制剂PD98059预处理的转染组细胞中MxA、STAT1的mRNA水平接近于空载体组和未转染组细胞水平。HepG2.2.15细胞被转染并表达抗病毒蛋白MxA后,其上清液中HBsAg和HBeAg的分泌量明显低于IFN-α单独处理组(P<0.05)。
　　结论：(1)HBx蛋白影响IFN-α诱导的JAK-STAT信号转导途径分子的激活,抑制抗病毒蛋白MxA的表达;(2)ERK信号转导途径(细胞外调节蛋白激酶途径)的活化可能参与这一抑制过程;(3)在体外,抗病毒蛋白MxA与IFN-α联合应用可以明显提高IFN-α的抗病毒效应。

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1前言

2 材料和方法

2.1实验仪器

2.2 实验试剂

2.3 质粒来源

2.4 试剂的配制

2.5 实验方法

2.6 实验分组

2.7 统计分析

3 结果

3.1 细菌在卡那霉素和氨苄霉素培养板筛选结果

3.2 质粒的表达

3.3 Western blot 分析各组细胞中ERK磷酸化水平

3.4 细胞总RNA检测

3.5 RT-PCR分析HBx蛋白对IFN-α诱导的MxA蛋白的影响

3.6 RT-PCR检测HepG2细胞中JAK/STAT信号转导通路的表达。

3.7 Western blot分析HBx蛋白对IFN-α诱导的STAT1蛋白磷酸化(p-STAT1)及表达总量(t-STAT1)的影响

3.8 各组HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg分泌结果

3.9 各组 HepG2.2.15细胞上清中HBV DNA的表达

4 讨论

5 结 论

参考文献

附录一：

附录二：

综述