葡萄酒植物乳杆菌SA-680耐酸标记基因的功能研究

摘要

植物乳杆菌是葡萄酒苹果酸-乳酸发酵过程中一类具有增香酿造潜力的乳酸菌，然而多数植物乳杆菌不能够耐受葡萄酒酸性环境。因此，研究优良植物然乳杆菌的潜在耐酸基因，解析其在酸胁迫条件下的生理功能对揭示苹果酸-乳酸发酵过程中的微生物种群演变规律以及生产实践都有着重要的指导意义。　　本研究以从葡萄酒中分离的优良植物乳杆菌XJ25为试验材料，以SA-680耐酸标记基因为研究对象，采用基因敲除的方式对植物乳杆菌SA-680耐酸标记基因的生物学功能进行解析，主要的研究结果如下：　　（1）甲基化修饰作用是影响敲除质粒pLCNICK电转化植物乳杆菌XJ25的主要原因；感受态细胞收集时间为OD600=0.2时的电转化效率最高，达到1.83×105 CFU/μg DNA；在一定范围内，植物乳杆菌XJ25电转化效率随着电场强度的增加而升高，在达到峰值（2.08×105CFU/μg DNA）后下降；植物乳杆菌XJ25电转化效率与质粒浓度呈现负相关的趋势，但与电击次数不相关。　　（2）通过重叠延伸PCR技术和多片段一步克隆技术构建了带有不同sgRNA的靶基因敲除载体pLCNICK-△mdt-sgRNA1和pLCNICK-△mdt-sgRNA2，测序结果显示载体构建过程未引入碱基突变；将两个敲除载体电转化植物乳杆菌XJ25，转化pLCNICK-△mdt-sgRNA1后能够获得转化子，而pLCNICK-△mdt-sgRNA2不能获得转化子；通过无抗传代获得了未引入外源质粒DNA的靶基因敲除突变株植物乳杆菌XJ25-△mdt。　　（3）野生型植物乳杆菌XJ25和靶基因敲除突变株植物乳杆菌XJ25-△mdt在pH=3.5条件下的最大生物量具有显著性差异（p<0.01），然而在OD600数值上仅相差0.02，该SA-680耐酸标记基因的主要生物学功能可能不是耐酸表型。

目录

声明

第一章文献综述

1.1苹果酸-乳酸发酵简介

1.2葡萄酒植物乳杆菌研究进展

1.3植物乳杆菌基因敲除工具研究

1.4研究目的和内容

1.5技术路线

第二章葡萄酒植物乳杆菌电转条件优化

2.1试验仪器与材料

2.2试验方法

2.3试验结果与分析

2.4本章小节

第三章葡萄酒植物乳杆菌SA-680标记基因缺失菌株的构建

3.1试验仪器与材料

3.2试验方法

3.3试验结果与分析

3.4本章小节

第四章植物乳杆菌SA-680标记基因缺失株的表型变化

4.1试验仪器与菌株

4.2试验结果与分析

4.3本章小节

第五章结论与展望

5.1结论

5.2创新点

5.3展望

参考文献

附录

致谢

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