lncRNA HOTAIR、MDA9蛋白及GRP78蛋白在恶性黑色素瘤侵袭和转移中的研究

摘要

恶性黑色素瘤是一种恶性程度极高的皮肤肿瘤,是皮肤病中死亡率最高的疾病。侵袭和转移是影响该疾病患者生存的首要因素,也是其治疗的最大障碍。关于恶性黑色素瘤的侵袭及转移的机制尚不十分清楚。因此,有必要对其侵袭和转移机制进行研究,进而为临床诊断、防治恶性黑色素瘤的侵袭和转移提供分子水平的新型治疗方法。
　　目的：
　　1、通过定量反转录PCR从6个长链非编码RNA(lncRNA)中筛选出与恶性黑色素瘤转移相关性最大的lncRNA,研究它与恶性黑色素瘤的侵袭和转移的关系,以期为恶性黑色素瘤侵袭和转移的治疗提供靶目标;
　　2、通过双向电泳实验从3对原发黑色素瘤组织及对应的淋巴结转移组织中筛选出与恶性黑色素瘤的侵袭和转移相关的蛋白,以期发现它们影响恶性黑色素瘤侵袭和转移的机制,为临床诊断、防治恶性黑色素瘤的侵袭和转移提供分子水平的新型治疗方法。
　　方法：
　　1、从3对原发黑色素瘤组织及对应的淋巴结转移组织中提取出总 RNA,再用总RNA通过反转录PCR从6个长编码RNA中选出与恶性黑色素瘤侵袭和转移相关性最大的lncRNA;
　　2、从3对原发黑色素瘤组织及对应的淋巴结转移组织中提取出总的蛋白质,通过双向电泳实验筛选出与恶性黑色素瘤侵袭和转移相关的蛋白,并从中挑选出在原发及转移恶性黑色素瘤中表达差异明显的并可能存在相互作用的两种蛋白,再通过荧光定量PCR验证双向电泳实验的结果;
　　3、通过分子克隆技术得到含编码这两种蛋白的基因的质粒,并将克隆得到的质粒转染到293T细胞中通过western blotting检测其蛋白的表达;
　　4、将筛选出的lncRNA及这两种蛋白的siRNA转染至A375细胞中,并通过PCR验证siRNA的下调功能;
　　5、用转染了筛选出的lncRNA及这两种蛋白的siRNA及非靶目标 siRNA(siControl)的A375细胞通过基质胶侵袭试验及划痕试验验证该lncRNA及蛋白对黑色素瘤侵袭和转移是否产生影响;
　　6、用转染了该lncRNA的siRNA及非靶目标siRNA(siControl)的A375细胞通过原位酶谱试验验证该lncRNA对恶性黑色素瘤细胞的白明胶酶活性是否产生影响;
　　7、通过CO-IP试验验证这两种蛋白之间是否存在相互作用;
　　8、如果这两种蛋白之间存在相互作用,通过相关软件推测这两种蛋白相互作用的可能机制,并通过相应的试验进行验证这种作用机制对恶性黑色素瘤的侵袭和转移起作用。
　　结果：
　　1、通过反转录PCR筛选出lncRNA HOTAIR与恶性黑色素瘤的侵袭和转移相关,并通过划痕试验、侵袭试验以及原位酶谱试验充分证实了lncRNA HOTAR能促进恶性黑色素瘤的侵袭和转移。
　　2、通过双向电泳实验筛选出MDA9及GRP78这两种蛋白与恶性黑色素瘤侵袭和转移相关,并通过划痕试验及侵袭试验证实了MDA9及GRP78这两种蛋白能促进恶性黑色素瘤的侵袭和转移,但这两种蛋白是否存在相互作用以及它们促进恶性黑色素瘤侵袭和转移的机制有待进一步研究。
　　讨论：
　　1、本实验证实了lncRNA HOTAR能促进恶性黑色素瘤的侵袭和转移,尽管需要进一步关于HOTAIR对肿瘤侵袭和转移的影响机制的研究,但在该研究中所观察到的HOTAIR转移活性说明HOTAIR可能是治疗恶性黑色素瘤侵袭和转移的潜在靶目标。
　　2、本实验证实了MDA9及GRP78这两种蛋白的表达能促进恶性黑色素瘤的侵袭和转移,但尚需进一步的研究证明这两种蛋白是否存在相互作用以及它们促进恶性黑色素瘤侵袭和转移的机制,从而为临床诊断、防治恶性黑色素瘤侵袭和转移提供分子水平的新型治疗方法。

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英文摘要

第一部分 lncRNA HOTAIR 在黑色素瘤侵袭和转移中的研究

实验一 6个lncRNAs定量反转录PCR

实验二 siHOTAIR转染A375细胞及其功能实验

讨论

第二部分 MDA9及GRP78与恶性黑色素瘤侵袭和转移机制的研究

实验一 与黑色素瘤侵袭和转移相关蛋白的筛选及PCR验证

实验二 siRNA在A375细胞中基因下调功能的验证

实验三 划痕试验及基质胶侵袭试验

实验四 分子克隆及western blotting对其表达的验证

实验五 免疫共沉淀实验（CO-IP）

讨论

参考文献

附录

致谢

综述