产气荚膜梭菌α--β--ε毒素融合蛋白的表达及其免疫原性分析

目录

声明

符 号 说 明

前言

1.1 产气荚膜梭菌简介

1.1.1产气荚膜梭菌的生物学特性

1.1.2产气荚膜梭菌的基因组学

1.1.3 产气荚膜梭菌的主要毒素

1.1.4产气荚膜梭菌的致病性

1.1.5产气荚膜梭菌的检测技术

1.1.6产气荚膜梭菌的防治

1.2产气荚膜梭菌疫苗

1.3重组蛋白表达系统

1.3.1 大肠杆菌表达系统

1.3.2 毕赤酵母表达系统

1.4 松花粉多糖研究概述

1.4.1多糖的生物活性

1.4.2 松花粉多糖研究现状

1.5 研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1菌株和质粒

2.1.2 主要仪器

2.1.3 主要试剂与试剂盒

2.1.4主要培养基及其配制

2.2 Cp-abx 融合蛋白抗原决定簇软件分析

2.3 大肠杆菌表达载体PET28a-abx的构建

2.3.1 重组产气荚膜梭菌Cp-abx基因合成与扩增

2.3.2 重组产气荚膜梭菌Cp-abx基因克隆及测序

2.3.3 重组pET28a(+)-Cp-abx表达载体的构建

2.3.4 大肠杆菌阳性转化子的构建

2.3.5大肠杆菌诱导表达、鉴定和纯化

2.3.6 大肠杆菌Cp-abx 融合蛋白SDS-PAGE和Western blot分析

2.3.7 大肠杆菌Cp-abx 融合蛋白纯化及含量测定

2.4 毕赤酵母表达载体pPIC9-abx的构建

2.4.1重组毕赤酵母Cp-abx基因扩增

2.4.2 重组产气荚膜梭菌Cp-abx基因克隆及测序

2.4.3 pPIC9-Cp-abx重组表达载体的构建

2.4.4 毕赤酵母阳性转化子的构建

2.4.5 Cp-abx融合蛋白在毕赤酵母中的表达、鉴定及纯化

2.4.6 Cp-abx 融合蛋白SDS-PAGE和Western blot分析

2.4.7 Cp-abx 融合蛋白纯化和含量测定

2.5 产气荚膜梭菌毒素提取

2.5.1菌种复苏

2.5.2 生长曲线绘制

2.5.3 产气荚膜梭菌外毒素的提取

2.5.4 SDS-PAGE 检测产气荚膜梭菌毒素蛋白

2.5.5 粗提毒素的半数致死量(LD50)测定

2.6 融合蛋白与粗提毒素毒性对比分析

2.6.1 体内毒性分析

2.6.2 体外毒性分析

2.7 Cp-abx融合蛋白免疫效果评价

2.7.1免疫原制备

2.7.2 安全性检验

2.7.3动物免疫试验

2.7.4 数据分析

3结果分析

3.1 Cp-abx 融合蛋白抗原决定簇软件分析

3.2大肠杆菌表达载体PET28a-abx的构建

3.3 Cp-abx 融合蛋白在大肠杆菌原核表达、鉴定及纯化

3.4毕赤酵母表达载体pPIC9-Cp-abx的构建

3.5 Cp-abx融合蛋白在毕赤酵母中的表达、鉴定及纯化

3.6 Cp-abx 融合蛋白纯化和含量测定

3.7产气荚膜梭菌毒素提取

3.8 融合蛋白与粗提毒素毒性分析

3.8.1体内毒性分析

3.8.2 体外毒性分析

3.9 融合蛋白免疫效果的研究

3.9.1 血清抗体水平的测定

3.9.2 血清中细胞因子分泌结果分析

3.9.3 外周血CD4+、CD8+淋巴细胞含量的变化

3.9.4 外周血淋巴细胞转化率的测定

3.9.5 攻毒保护作用

3.9.6 组织切片分析

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

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