肿瘤相关巨噬细胞自噬状态对大肠癌细胞放射敏感性的影响

摘要

目的:研究肿瘤相关巨噬细胞自噬调控后对大肠癌LOVO细胞放射敏感性的影响。　　方法:使用佛波酯PMA、人重组IL-4诱导人单核白血病细胞THP-1分化为肿瘤相关巨噬细胞(Tumor associated macrophages,TAM)后,镜下观察细胞形态并使用流式细胞仪检测其表面CD68、CD204、CD206分子表达情况;分别使用一定浓度的RAD001,Bafilomycin a1对TAM的自噬状态进行调控,应用MDC荧光染色法观察TAM自噬囊泡形成,免疫荧光检测自噬特异性微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein1 light chain3,LC3)表达;利用Transwell小室将不同自噬状态的TAM与大肠癌细胞行非接触式共培养,实验分组为TAM自噬上调组、下调组、未调组及单独大肠癌LOVO细胞的空白对照组4组,各组经4Gy射线照射后分别行大肠癌细胞克隆集落形成、细胞存活分数、凋亡细胞比例、放射敏感相关蛋白Bcl-2、Survivin、Smac表达水平的检测。　　结果:人单核白血病细胞THP-1在经过佛波酯PMA、人重组IL-4依次作用总计72小时后,所得TAM表面CD68、CD204、CD206表达水平(依次为62.32±1.58％、33.49±2.11％、52.42±2.65％)显著高于未经处理的THP-1细胞(依次为39.69±1.59％、8.56±1.25％、7.93±0.53％)和只经PMA作用得到的未活化巨噬细胞(依次为49.72±1.82％、7.90±1.19％、14.39±0.85％)(P<0.05)。分别使用RAD001,Bafilomycin a1调控TAM自噬水平后发现,自噬上调组中MDC染色的自噬囊泡数目多于自噬未调组,LC3荧光也强于自噬未调组;自噬下调组中MDC染色的自噬囊泡数目少于自噬未调组,LC3荧光强度则弱于自噬未调组;且药物的自噬调控作用可维持至少48h。共培养细胞同时接受照射处理后,TAM自噬未调组中大肠癌细胞克隆形成率(7.12±0.14％)与存活分数(71.12±0.34％)均高于对照组(分别为3.98±0.73％、39.7±1.14％),TAM可促进大肠癌细胞增殖(P<0.05);改变TAM自噬状态可影响其促大肠癌细胞增殖效应:TAM自噬上调组大肠癌细胞克隆形成率为(4.21±0.18％),低于自噬未调组(7.12±0.14％)和自噬下调组(5.28±0.23％),提高TAM的自噬水平可抑制其促大肠癌细胞增殖效应,且抑制效果较下调TAM自噬水平更为显著(P<0.05)。Annexin V/PI双染检测大肠癌细胞凋亡显示:共培养组中大肠癌细胞凋亡率(分别为36.84±0.37％、43.23±1.34％、29.37±0.82％)均高于对照组(27.23±0.63％),TAM可诱导大肠癌细胞凋亡的发生(P<0.05);其中,TAM自噬上调组中大肠癌细胞凋亡率(43.23±1.34％)又高于自噬下调组(29.37±0.82％)和自噬未调组(36.84±0.37％),上调TAM自噬水平可显著提高其促大肠癌细胞凋亡效应(P<0.05)。各组大肠癌细胞放射敏感相关蛋白的检测结果显示:TAM自噬未调组中Bcl-2表达量为(0.24±0.02)、上调组为(0.08±0.01)、下调组为(0.42±0.02),均低于对照组(0.61±0.05),TAM可下调大肠癌细胞的Bcl-2表达(P<0.05);共培养组中Smac表达水平(分别为1.26±0.03、1.49±0.24、0.85±0.03)均高于对照组(0.68±0.03)(P<0.05);共培养组中Survivin表达水平(分别为0.48±0.01、0.23±0.02、0.55±0.05)均低于对照组(0.80±0.05)(P<0.05)。上调TAM自噬水平可显著抑制大肠癌细胞的Bcl-2(0.08±0.01)和Survivin(0.23±0.02)表达量,增加Smac(1.49±0.24)表达水平,提高大肠癌细胞的放射敏感性。　　结论:上调TAM自噬水平可显著抑制其促大肠癌细胞增殖效应,增强其促大肠癌细胞凋亡作用,改变大肠癌细胞放射敏感相关蛋白的表达,提高大肠癌细胞的放射敏感性。

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研究背景

参考文献

引言

材料与方法

一、材料

二、方法

结果

1、TAM的诱导及鉴定

2、TAM自噬状态的检测

3、各组大肠癌细胞克隆形成率与细胞存活分数

4、Annexin V/PI双染检测大肠癌细胞凋亡情况

5、Western blot检测各组大肠癌细胞放射敏感相关蛋白表达

讨论

结论

参考文献

综述

参考文献

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