茶树中咖啡碱合成酶基因的抑制及在其它生物体中的表达

摘要

咖啡碱(1,3,7-三甲基黄嘌呤)是茶叶中嘌呤碱的主体成份,约占干物质量的25％.它是世界上应用最广泛的药剂之一,适度摄入咖啡碱可以兴奋神经中枢,有利于提高反应速度、集中注意力和消除疲劳.然而,摄入过量的咖啡碱会对人体产生短期的负面作用,如会引起心悸、胃肠痛、焦虑、烦躁、失眠、呼吸频率增加、血压升高、心率失常,并可能诱导心肌梗塞和冠心病的的发生;另外,摄入过量咖啡碱还可增加患某些癌症(如尿道癌、膀胱癌、乳腺癌等)的机率.正是由于以上这些不利的负面作用,所以在国内及国际市场上,都希望有脱(低)咖啡碱的茶叶和茶饮料的产品.该研究以龙井43<'＃>为材料,比较系统地研究了茶树的再生体系,克隆并在大肠杆菌中和烟草中表达了茶树咖啡碱合成酶(tea caffeine synthase,TCS)基因.另外,还利用反义RNA技术和双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)技术抑制咖啡碱合成酶基因的表达.

目录

文摘

英文文摘

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第一章引言

1.1 茶树中咖啡碱的研究进展

1.1.1茶树体内咖啡碱的生物合成

1.1.2咖啡碱对人体的副作用

1.1.3茶叶中脱咖啡碱的方法

1.2 茶树基因工程的研究进展

1.2.1农杆菌介导茶树遗传转化

1.2.2基因枪介导茶树遗传转化

1.3 反义RNA技术及其在植物中的应用

1.3.1反义RNA的发现

1.3.2反义RNA技术的原理

1.3.3反义RNA技术在植物学研究中的应用

1.4 双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)技术及应用

1.4.1 dsRNA技术的发明及原理

1.4.2 dsRNA介导的转基因沉默的特点

1.4.3 dsRNA介导的转录后基因沉默的其它生物学功能

1.4.4 dsRNA技术的应用

1.5 本研究的背景、目的和意义

1.6 本研究的技术路线

1.7 本研究的主要内容

第二章茶树再生体系的建立

2.1 材料和方法

2.1.1植物材料

2.1.2实验方法

2.2 结果与分析

2.2.1不同灭菌方式对外植体污染率及成活率的影响

2.2.2不同培养基对茶树叶片外植体愈伤组织诱导的影响

2.2.3 叶柄外植体的离体培养

2.2.4茎段的离体培养

2.2.5茶树未成熟子叶及成熟子叶的离体培养

2.3 讨论

2.3.1茶树愈伤组织的诱导

2.3.2茶树组织培养的器官分化情况

2.3.3从茶树子叶诱导体细胞胚

2.3.4茶树组织培养过程中的褐变问题

2.4 本章小结

第三章茶树咖啡碱合成酶基因cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

3.1 材料与方法

3.1.1材料

3.1.2实验方法

3.2 结果和分析

3.2.1茶树叶片总RNA的提取鉴定

3.2.2 TCS基因cDNA片段的克隆

3.2.3表达载体的构建

3.2.4 TCS cDNA在大肠杆菌中的表达

3.3 讨论

3.4 本章小结

第四章茶树咖啡碱合成酶基因cDNA在烟草中的表达

4.1 材料与方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2 结果与分析

4.2.1茶树咖啡碱合成酶基因cDNA全长的克隆

4.2.2表达咖啡碱合成酶的中间表达载体的构建

4.2.3三亲杂交法制备转化工程菌

4.2.4烟草叶片再生体系的优化

4.2.5叶盘法转化烟草叶片

4.2.6转基因烟草的PCR鉴定和Southern blotting鉴定

4.2.7转基因烟草植株RT-PCR鉴定和Northern blotting鉴定

4.2.8转基因烟草植株CS酶活性

4.2.9转基因烟草中咖啡碱的测定

4.3 讨论

4.4 本章小结

第五章茶树中咖啡碱合成酶基因的反义抑制及dsRNA抑制

5.1 材料与方法

5.1.1材料

5.1.2方法

5.2 结果

5.2.1茶树咖啡碱合成酶cDNA部分片段的克隆

5.2.2 TCS反义RNA中间表达载体的构建

5.2.3 TCS反义RNA中间表达载体转化农杆菌

5.2.4 TCS dsRNA表达载体的构建

5.2.5 TCS dsRNA表达载体向农杆菌的转化

5.2.6农杆菌介导的茶树遗传转化及转化体的鉴定

5.3讨论

5.3.1关于应用RNA技术培育低咖啡碱茶树

5.3.2关于dsRNA表达载体pBI-dsTCS的构建策略

5.3.3农杆菌介导的茶树遗传转化

5.4 本章小结

第六章结论

参考文献

致谢

附录1中英文缩写与注释

附录2测序结果与GenBank登录的TCS序列比对图

作者简介