产纤维素酶真菌的筛选、发酵条件优化及酶学性质的研究

摘要

本实验从土壤中、昆虫消化道及阴暗潮湿的环境中分离产纤维素酶的微生物，经过结晶紫选择培养基初筛和刚果红纤维素选择培养基的复筛，得到约三十株能够利用纤维素作为唯一碳源的菌株，通过比较，最终选择一株青霉菌RCEF4093菌株作为目标菌株，通过与本实验室保存的黑曲霉、甘肃曲霉和绿色木霉比较，具有产酶量高，产酶稳定等特点。经形态特征和生理生化特征初步鉴定为半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，青霉属。对其产酶培养条件进行了优化，纯化出葡聚糖内切酶并测定了其酶学性质。
　　 由于纤维素酶的合成是发生在基本碳源基本耗尽后，以不溶性纤维素为唯一碳源时，因此在本实验中除诱导物实验外所有摇瓶及斜面培养基均不含还原糖成分。
　　 对RCEF4093菌株进行发酵培养条件作了优化。优化后的液态发酵条件如下：以0.3％稻草粉和0.2％麸皮为碳源，0.2％硫酸铵，0.01％精氨酸，初始pH为5～6，培养温度30℃，培养90h，产酶活力最高，CMC酶活为293.74IU/mL，FPA酶活为67.31IU/mL。
　　 对所分离得到的产纤维素酶菌目标菌株发酵液中的纤维素酶组分进行了分离纯化研究。发酵液通过金属网过滤和离心去除菌体和其他杂质后，经过旋转蒸发仪浓缩，得到浓缩后的发酵液。通过两次硫酸铵沉淀，以上清酶活最小，沉淀酶活最大同时保证蛋白质不在高盐浓度下变性为依据。确定40％-60％的硫酸铵浓度作为最佳硫酸铵饱和浓度。后通过透析除去盐离子，得到粗酶组分。粗酶通过离心去除杂质后用Sephadex G-75柱层析，280nm检测显示有三个峰，进一步检测酶活发现第三个峰具有葡聚糖内切酶活性，能够有效地降解CMC（羧甲基纤维素钠），经过SDS-PAGE检测蛋白组分，电泳显示主要成分为一条单带，存在少量杂蛋白。经过酶活测定其纯化倍数为2.54倍。
　　 对纯化得到的葡聚糖内切酶的基本酶学性质进行了研究。通过文献检索和比较，选择3％浓缩胶和10％的分离胶作为电泳胶板，以低分子量标准蛋白为marker电泳。SDS-PAGE显示主要成分为该酶的单体蛋白，其相对分子量为39.2kD，动力学方法测得该酶对最适底物的Km值为6.07×10-2g/mL，该酶的最适pH为5，在pH3-6有较强的稳定性；最适反应温度为50℃，在60℃以下能长时间地保持较高活性。

目录

文摘

英文文摘

声明

1.文献综述

2　引言

3.材料与方法

3.1材料

3.2方法

4.结果与分析

4.1菌种分离结果

4.2葡萄糖标准曲线

4.3发酵条件对产酶结果的影响

4.3.1不同碳源对产酶结果的影响

4.3.2稻麸比对产酶结果的影响

4.3.3不同氮源对产酶结果的影响

4.3.4初始pH对产酶结果的影响

4.3.5不同培养时间对产酶结果的影响

4.3.6培养温度对产酶结果的影响

4.3.7通气量对产酶结果的影响

4.3.8诱导物对产酶结果的影响

4.3.9发酵培养基优化实验

4.4蛋白质标准曲线

4.5酶的纯化

4.5.1纤维素酶的硫酸铵沉淀

4.5.2纤维素酶sephade G-75柱层析

4.6酶学性质

4.6.1葡聚糖内切酶分子量的测定

4.6.2葡聚糖内切酶Km、Vmax的测定

4.6.3葡聚糖内切酶的最适反应温度

4.6.4葡聚糖内切酶的最适pH

4.6.5葡聚糖内切酶的热稳定性研究

4.6.5葡聚糖内切酶的酸碱稳定性研究

5.讨论

6.结论

参考文献

致谢

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