大豆抗原蛋白对仔猪肠道的致敏作用及ELISA检测方法的建立

摘要

大豆中的抗原蛋白能引起机体发生过敏反应，不仅威胁人类的健康，也给畜禽业造成巨大的经济损失。本试验通过高纯度的大豆抗原蛋白致敏仔猪，研究大豆抗原蛋白对仔猪肠道的致敏作用，同时建立一种仔猪大豆抗原蛋白血清抗体间接酶联免疫吸附反应(ELISA)的检测方法，以期为动物大豆抗原蛋白致敏提供临床诊断方法。
　　大豆抗原蛋白对仔猪肠道的致敏作用。试验采取完全随机设计，将30头临床检查健康的21日龄断奶仔猪随机分为3个组，每组10头，分别为对照组、大豆球蛋白(11S)致敏组和β-伴大豆球蛋白(7S)致敏组。在仔猪21～27日龄与32～34日龄时，分别进行初次致敏和再次致敏。其中，11S和7S致敏组，在基础日粮中分别添加4％的11S蛋白和4％的7S蛋白（纯度分别为80％和85％）。在仔猪21、28和35日龄时，用EDTA抗凝管进行前腔静脉采血，用于ELISA试剂盒测定血浆D-乳酸、二胺氧化酶和5-羟色胺含量水平;在仔猪35日龄时，进行皮肤致敏试验;在36日龄时，每组随机选择5头仔猪屠宰，取十二指肠近端、空肠近端、空肠中段、空肠远端、回肠远端各6 cm，用免疫组化方法测定分泌型IgA阳性表达分布及强弱。
　　仔猪大豆抗原蛋白血清抗体间接ELISA检测方法的建立。试验分组及处理方法同上。在21、28和35日龄时，每天上午7:00～8:00对所有试验仔猪空腹采血，室温静置2h后，3000 r·min-1离心10 min，分离血清，并在35日龄时做皮肤致敏试验。采用棋盘滴定法确定最佳抗原包被质量浓度及血清稀释倍数，并对其他条件进行优化，建立检测血清大豆抗原蛋白11S、7S抗体的间接ELISA方法，确立待测血清判定标准，并对建立的ELISA方法进行重复性、准确性和敏感性检测。
　　试验结果如下:
　　1.皮肤致敏试验后，所有致敏组仔猪11S和7S蛋白注射点皮肤反应均较明显，评判结果在“+”级以上，7S蛋白致敏组仔猪的反应尤为明显，评判结果达到“++”级以上，证明大豆抗原蛋白可使35日龄仔猪产生过敏反应。
　　2.在28和35日龄时，大豆抗原蛋白致敏组仔猪血浆D-乳酸含量水平、二胺氧化酶活力和5-羟色胺含量水平与对照组相比显著升高(P＜0.01)，结果表明血浆D-乳酸含量水平和二胺氧化酶活性与肠道损伤具有很强的相关性。对大豆抗原蛋白致敏仔猪血浆5-羟色胺含量进行检测，发现5-羟色胺在机体内随着日龄的增加呈先低后高再低的趋势，肠道生理功能的强弱与血浆5-羟色胺含量变化有一定的关系。
　　3.试验用免疫组化的方法，分别对仔猪的十二指肠、空肠近端、空肠中段、空肠远端和回肠远端的分泌型IgA阳性表达分布及强弱进行比较，发现空肠中段阳性分布和光密度值明显高于其他各试验组肠段，7S致敏组仔猪阳性表达强度尤为明显，其次是11S致敏组。小肠5段肠管中分泌型IgA阳性表达光密度值从强到弱依次为:空肠中段＞十二指肠＞空肠近端、回肠远端＞空肠远端。
　　4.建立了仔猪血清大豆抗原蛋白间接ELISA检测方法。其中，11S蛋白的最适包被质量浓度为2.0μg·mL-1，包被作用时间为37℃下2h;封闭液为10 g·L-1BSA，37℃封闭1 h;待测血清最适稀释度为1∶1600，37℃作用1 h;酶标抗体最适稀释度为1∶1500，37℃作用1 h;最佳显色时间15min。7S蛋白的最适包被质量浓度为2.5μg·mL-1，包被作用时间为37℃下2h;封闭液为10 g·L-1 BSA，37℃封闭1h;待测血清最适稀释度为1∶1600，37℃作用1h;酶标抗体最适稀释度为1∶1500，37℃作用1h;最佳显色时间25 min。11S和7S抗原蛋白间接ELISA检测方法的批内、批间变异系数均小于10％，重复性较好，灵敏度较高。
　　5.在临床上对已建立的间接ELISA方法进行敏感性和准确性检测，并确定11S抗原蛋白抗体的间接ELISA方法敏感性为87.5％(7/8)，准确性为81.3％(13/16);7S抗原蛋白抗体的间接ELISA方法敏感性为87.5％(7/8)，准确性为87.5％(14/16)。
　　试验表明，大豆抗原蛋白对仔猪肠道具有致敏作用，并能改变肠道的正常生理状态。当仔猪肠道发生致敏反应时，肠道黏膜会释放大量的分泌性IgA;建立了检测仔猪血清大豆抗原蛋白抗体的间接ELISA方法，该方法具有很强的特异性和敏感性，可用于大豆抗原蛋白11S、7S过敏反应的临床诊断。

目录

声明

摘要

中英文缩写词

文献综述

引言

1 材料与方法

1．1 试验动物

1．2 试剂和仪器

1．2．1 大豆抗原蛋白对仔猪肠道致敏作用试验

1．2．2 大豆抗原蛋白血清抗体间接ELISA检测方法试验

1．3 试验分组及方法

1．4 试验仔猪饲养管理

1．5 仔猪样品的采集与处理

1．5．1 仔猪血清的采集与处理

1．5．2 仔猪血浆的采集与处理

1．5．3 仔猪肠管的采集与处理

1．6 大豆抗原蛋白的皮肤致敏试验

1．7 检测指标及方法

1．7．1 血浆D-乳酸、二胺氧化酶、5-羟色胺含量水平

1．7．2 肠道sIgA采用免疫组化PV6000法

1．8 11S和7S抗原蛋白血清抗体间接ELISA检测方法的建立

1．8．1 11S和7S抗原包被最佳浓度和酶标抗体稀释最佳浓度的确定

1．8．2 抗血清的稀释倍数及加样方法

1．8．3 最佳试验反应条件的标准及其筛选

1．8．4 11S蛋白和7S蛋白抗血清的交叉反应

1．8．5 重复性试验

1．8．6 待检测结果的判定方法

1．8．7 间接ELISA法检测大豆抗原蛋白抗体方法的应用

1．9 数据处理

1．9．1 试验血清指标的结果处理

1．9．2 组织学图片处理

2 结果与分析

2．1 大豆抗原蛋白皮肤致敏试验

2．2 血浆中D-乳酸、二胺氧化酶、5-羟色胺含量水平

2．2．1 血浆中D-乳酸含量水平

2．2．2 血浆中二胺氧化酶活力

2．2．3 血浆中5-羟色胺含量水平

2．3 肠道分泌型IgA免疫组化阳性表达

2．3．1 分泌型IgA免疫组化图片

2．3．2 分泌型IgA免疫组化阳性表达光密度值

2．4 大豆抗原蛋白间接ELISA检测条件的优化

2．4．1 11S和7S抗原蛋白间接ELISA酶标抗体的最适稀释倍数的确定

2．4．2 11S和7S抗原包被最佳浓度和阳性血清最佳稀释倍数的确定

2．4．3 ELISA最佳反应条件确定

2．4．4 交叉性试验

2．4．5 重复性试验

2．4．6 检测结果的判定标准

2．4．7 间接ELISA法检测大豆抗原蛋白抗体临床应用的准确性

3 讨论

3．1 大豆抗原蛋白对皮肤致敏反应

3．2 大豆抗原蛋白对肠道通透性的影响

3．3 大豆抗原蛋白对体内5-羟色胺含量水平的影响

3．4 大豆抗原蛋白对分泌型IgA的影响

3．5 大豆抗原蛋白血清抗体间接ELISA方法的建立

3．6 存在的问题

4 结论

参考文献

附录

致谢

作者简介